SDS-PAGE凝胶电泳

蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳

一 目的

掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 二 原理

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。

因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。

基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量 三 试剂和器材

试剂：1低分子量标准蛋白质

2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液）

3 凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4°暗处贮存，一个月内使用

4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至1000ml

5 10%(w/v)SDS

6 10%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配） 7 四甲基乙二胺（TEMED）

8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g， 溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。

9 2×样品稀释液： SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油 3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。 10 固定液：500ml 乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 11 脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 12 染色液： 0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中 器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽 四 操作步骤 1分离胶制备： 凝胶浓度 凝胶贮液ml 1mol/LPH8.8 Tris-HClml 水 ml 10% SDS ml 10% 过硫酸铵 ml TEMED (μL) 5% 5 11.2 13.7 7.5% 7.5 11.2 11.2 10% 10 11.2 1.2 0.3 0.1 20 12.5% 12.5 11.2 8.7 15% 15 11.2 3.7 将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形成凹槽处处平齐，而后插入“加样梳”，在室温下放置1小时左右，分离胶即可完全凝集。凝聚后，慢慢取出“加样梳”，取出时应防止把加样孔弄破，取出“加样梳”后，在形成的加样孔中加入蒸馏水，冲洗未凝集的丙烯酰胺，倒出加样孔中的蒸馏水后，在加入已稀释的电极缓冲液。 2, 样品制备： 标准蛋白质制备

待测蛋白样品制备：

液体待测样品，可取500μL，加入等体积的“2×样品稀释液”，混匀，在沸水浴中加热5min,

取出，冷却至室温备用。若液体待测样品蛋白质浓度太稀可经浓缩后再制备。

3，点样

用微量进样针吸取上述蛋白质样品20μL分别加入到各个加样孔中，为了获得准确的结果，每

个样品应做两次重复。

4，电泳

将电泳槽与电泳仪连结，在电泳槽中加入已经稀释的电极缓冲液，打开电源，选择合适电压，保持恒电压300V，进行电泳，直至样品中燃料迁移至离下端1cm处，停止。 5，固定，染色，脱色

将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上（染色时间需根据凝胶厚度适当调整）。取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。

凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。

淀粉酶活性电泳

浓缩胶（单板）：

水：1.8ml 凝胶贮液：0.5ml PH6.8缓冲液：0.78ml 10%SDS :34μL TEMED:30μL 10%AP:25μL 上样要少，4μL即可；

电泳完毕后，胶用清水冲洗两遍，再用2mol/l Tris溶液浸泡1h； 蒸馏水洗干净，倒入1%淀粉溶液，震荡水浴锅中，37°反应10min； 取出，加入碘-KI（0.2%：2%）溶液显色； 灯箱观察拍照。

糖电泳

电极缓冲液 0.09 MTris 0.08M硼酸 2.6mMEDTA 胶

7.5ml凝胶贮液 15ml贮液 7.5ml水 TEMED 60 微升 10%AP 90微升

贮液

0.2 Mtris 0.2m 硼酸 2mmEDTA

进样缓冲液

4× 2M蔗糖（10ml贮液)

在实验中, 对电泳缓冲系统进行了改进, 即采用pH 9.4 硼砂- 氢氧化钠缓冲液; 同时对电泳条件进行了优化探讨, 重点对多糖PAS染色方法进行研究, 得到较佳的多糖和糖蛋白电泳后的PAS染色法:即先用10%TCA 处理5 min; 再用1% 高碘酸处理15 min; 蒸馏水洗涤3 次, 每次5 min; 倒入Schiff试剂避光染色30 min; 然后用0.5% 偏重亚硫酸钠洗3 次, 每次5 min。以上各步均在室温下及转速为85 r·min-1 的脱色摇床中进行, 于7% 的醋酸溶液中保存。此法操作更加简便, 染色处理过程更加快速, 所需时间为1.8 h。

（王玉琪,巫光宏, 林先丰, 贺丽平, 黄卓烈.多糖和糖蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进. 植物生理学通讯, 2009,45(2):169-172）

阿利辛蓝-硝酸银染色

1. 1 mg/ml 阿利辛蓝水溶液 30min，吸走染料 2. 除离子水洗涤数次，并可以在除离子水中过夜

3. 胶在3.4 mM重铬酸钾-3.2 mM 硝酸中处理7min，除离子水水洗数次 4. 凝胶浸泡在12 mM硝酸银(100w日光灯下30-40cm)处理25min 5. 吸走硝酸银,迅速倒入0.28M碳酸钠(含有6mM甲醛),然后迅速倒掉 6. 重新倒入该溶液,将胶浸没后再次倒掉

7. 再次倒入该溶液, 直到显色, 加入0.1M醋酸溶液冲洗，终止反应。 硝酸银染色

PAGE+50%乙醇洗三次，15min/ci

2%硫代硫酸钠稀释50倍染12min, 水洗3次，20s 2%硝酸银稀释10倍，染20 min，水洗3次。每次10s 6%碳酸钠（50μ/100ml甲醛）显色，直到清晰，10%乙酸终止

活性物质的SDS-PAGE电泳检测（夹层胶电泳）

参照孙雪文等建立的Tricine-SDS-PAGE系统，对纯化的Fengycins进行电泳检测。具体电泳体系见（表5-1，表5-2，表5-3）：

表Tricin-SDS-PAGE电泳溶液 Table Stock sollutions for Tricine-SDS-PAGE

缓冲液

Tris（mol/L）

Triscine（mol/L）

pH

SDS（%）

+极 -极

0.2 0.1 3.0

/ 0.1 /

8.9a 8.25b 8.45a

/ 0.1 0.3

凝胶

Notes：a means modified pH with HCl, b means no HCl added, natural pH is 8.25.

表5-2 丙烯酰胺储存液

Table 5-2 Acrylamide-bisacrylamide mixture

丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺含量 （w/v）

49.5%、3%（3C） 49.5%、6%（6C）

丙烯酰胺含量 （w/v） 48 46.5

表5-3 凝胶的组成

Table 5-3 Composition of separating, spacer and stacking gels

组成

3C凝胶储存液（mL） 6C凝胶储存液（mL）

浓缩胶 0.3 / 0.93 / / 2.23

夹层胶 1.22 / 2 / 0.26 5.22

致密胶 / 2 2 2.16 0.3 6

甲叉双丙烯酰胺含量 （w/v） 1.5 3.0

凝胶缓冲液（mL） 尿素（g） 甘油（mL）

加双蒸水定溶至（mL）

凝胶制作采用三层不连续胶的系统,先灌下边的致密胶和夹层胶,然后铺水层,待胶凝后,除去水层,灌上面的浓缩胶,小心插入梳子,静置30ml 加入150μl 10 %APS 和15μlTEMED

Tricine–SDS-PAGE

16 | VOL.1 NO.1 | 2006 | NATURE PROTOCOLS

Reducing sample buffers:

? Buffer A: 12% SDS (wt/vol), 6% mercaptoethanol (vol/vol), 30% glycerol (wt/vol), 0.05% Coomassie blue G-250 (Serva), 150 mM Tris/HCl (pH 7.0)

? Buffer A/4: buffer A diluted with 3 volumes of water ? Buffer C: buffer A without glycerol ? Nonreducing sample buffers:

? Buffer B: 12% SDS (wt/vol), 30% glycerol (wt/vol), 0.05% Coomassie blue G-250 (Serva), 150 mM Tris/HCl (pH 7.0)

? Buffer B/4: buffer B diluted with 3 volumes of water ? Buffer D: buffer B without glycerol

? Electrode buffer (semidry transfer only): 300 mM Tris, 100 mM acetic acid (pH 8.6)

Electrode and gel buffers for Tricine–SDS-PAGE

缓冲液 Tris（M） Triscine（M） HCL（M） SDS（%） pH

Anode buffer（10×） 1.0 - 0.225 - 8.9

Cathode buffer（10×） 1.0 1.0 - 1.0 ~8.25

Gel buffer（3×）

3.0 - 1.0 0.3 8.45

Tricine obtained from Serva. Keep solutions at room temperature (20–25 °C). Do not correct the pH of the cathode buffer, which ideally should be close to 8.25.

AB-3 stock solution

丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺含量 （w/v）

49.5%、3%（3C） 49.5%、6%（6C）

丙烯酰胺含量 （w/v） 48 46.5

甲叉双丙烯酰胺含量 （w/v） 1.5 3.0

For the acrylamide-bisacrylamide (AB)-3 stock solution(49.5% T, 3% C mixture), which is normally used, dissolve 48 g of acrylamideand 1.5 g of bisacrylamide (each twice-crystallized; Serva) in 100 ml of water. For the AB-6 stock solution (49.5% T, 6% C mixture), which is needed only foroptimal resolution of small proteins and peptides, dissolve 46.5 g of acrylamideand 3 g of bisacrylamide in 100 ml of water. ▲ CRITICAL Keep the

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