荧光定量PCR实验

Real-time PCR（SYBR GreenⅠ）实验

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。实时荧光定量PCR仪包括热循环仪、检测系统、计算机及软件分析系统。

一．实验目的

定量待测样品中靶DNA含量的多少及其动态变化。

二．实验原理

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

每个管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数(Ct值)与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。定量的方法一般常用的有三种：SYBR green I，TaqMan探针和Molecular Beacon。

图1.Ct值的确定

SYBR荧光染料法：在PCR反应体系中加入过量的SYBR荧光染料，SYBR

荧光染料特异性地掺入DNA双链后发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。但是在有非特异性扩增的情况下，不能采用SYBR green Ⅰ定量，因为非特异的扩增片段也会贡献荧光增量。

TaqMan荧光探针法：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个猝灭荧光基团。探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收。PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步，TaqMan探针特异性地结合在靶序列上，只有真正发生靶序列扩增的反应才会有荧光增量的产生。

图2.荧光强度-循环数曲线（a）；初始模板量对数-Ct 标准曲线（b）

近年来，荧光定量PCR技术广泛应用于DNA定量、RNA定量、SNP分析和基因型分析等方面。这里主要讨论荧光定量PCR技术在分子生态研究中的应用。

在微生物分子生态研究中，常常需要对生态系统中得有益微生物或有害微生物进行定量及跟踪定量检测，如在外界环境发生变化、系统功能发生紊乱、人为干扰等的情况下，对之进行动态跟踪定量检测，对于环境检测以及环境治理效果

的预测和评价上具有重要意义。

而传统的对于系统中重要的功能微生物的定量往往采用纯培养的办法，该方法虽然准确，但也只能针对那些易培养的微生物，且由于其费时费力，往往难以在实际的生产中应用。随着分子生物学的发展，人们采取设置内标的办法，在同一管PCR反应中，进行两个独立的PCR扩增反应，这种方法虽然理论上可行，但也由于其中的竞争、非特异等不确定的PCR反应本身的原因，结果并不理想。通过荧光原位杂交（FISH）的方法进行定量准确直观，但当群落数量水平较低时，又很难做到定量。实时荧光定量PCR技术的问世，解决了上述定量方法的不足，具有特异性更强、自动化程度更高并能有效解决PCR污染问题等优点，实时定量PCR技术已经广泛用于研究自然环境的微生物生态系统中，如土壤、水体、沉积物、活性污泥、肠道等复杂微生物生态系统中重要功能种群的定量研究。

三．实验材料

试剂：标准质粒；DNA样品；MIX；引物；无菌超纯水 仪器：荧光定量PCR仪；PCR八联管

四．实验方法

1）设计引物。根据16S测序的结果设计Real-time 正向和反向PCR引物（3-5个），需要设计大约50-150bp长度的引物，引物要避免出现二级结构和引物二聚体，确保正向引物和反向引物具有相似的退火温度，确保引物的GC含量在20-80%，这对用SYBR Green分析尽量减少非特异性扩增非常重要。 2）提取标准质粒DNA。由测序公司完成标准质粒DNA的提取，并返还。 3）稀释标准质粒。10倍拷贝数梯度稀释标准的DNA样品（如108、107、106、105），用于制备标准曲线。（仔细的制备和移取标准品对标准曲线的制备和定量非常重要，在做下一次稀释前要确保每一次稀释都充分的混匀）

4）测定标准质粒DNA的吸光度。用核酸定量仪在波长为A260/A280测定梯度稀释后各个浓度的质粒DNA的吸光度比率（纯的DNA=1.8），如果比率低于1.8则用酚-氯仿再次抽提质粒以便于去除蛋白等残留的污染物，DNA的吸光度为1时，DNA的浓度为50 μg ml-1。 5）准备好待测的DNA样品。

6）调配总体系反应液。可能不同的扩增反应需要的扩增条件如Mg2+、引物浓度等的不同，需要逐一摸索，这里提供一个一般常用的体系。

Universal SYBR Green Master Mix Forward Primer (12.5 μM) Reverse Primer (12.5 μM) Template Water Total 12.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 2.0 μl 9.5 μl 25 μl 7）将总体系分装后逐一加入模板，设置阴性对照、空白对照，至少取3个浓度梯度的标准质粒用于生成标准曲线，每个样品需要做三个副孔。（分装以及加模板过程要保证每个管内无气泡，否则可能影响荧光信号的检测）

8）将八连排管离心后放入到定量PCR仪中，设置样品号，设置程序，运行程序。 9）实时查看扩增情况。

10）运行结束后，生成标准曲线，记录样品的拷贝数，用于数据分析。

五．实验结果分析

实验结束后会得到标准曲线、扩增曲线、熔解曲线。在扩增曲线上读取Ct值到标准曲线上找到对应的起始拷贝数，通过换算可得到初始浓度。熔解曲线可以检测PCR的特异性，如鉴定有无PCR杂带，有无引物二聚体。

用计算得到的线性质粒的浓度来计算目的基因的浓度（拷贝数/μL）。计算重组质粒的百分比（目的扩增片段/重组质粒的全长，重组质粒全长为载体+插入片段）。例如对于150 bp的目的片段插入到3000 bp的载体中，目的片段的比例应该是150/3150 bp ?100 =4.76% insert DNA。如果检测到质粒的浓度是500 ng μL -1，插入的目标产物的浓度只是500 ng μL -1 ?4.76%=23.8 ng μL -1。插入片段的浓度可以转化成质粒的拷贝数/μL，用以下方程：

6.023?1023 (copies/mol) ?目标物的浓度 (g/μL)

RMM(g/mol)

插入的目标产物的摩尔质量（RMM）通过目标片段乘以每个碱基对的平均分子量（660 daltons）得到

RMM =150 bp ?660 Da = 99000 Da

ng和插入值的转化公式

6.023?1014 (Da /ng) ?23.8 ng/μL = 1.44?1011 copies of target plasmid/μL

99000 Da

结果可靠性的判定条件： 1)线性的标准曲线：R2＞0.980； 2)高扩增效率：90~110%；

3)重复性高：副孔之间的Ct值相差0.5以内；

六．注意事项

1.根据16S测序的结果设计Real-time 正向和反向PCR引物（3-5个）需要设计大约50-150bp长度的引物，引物要避免出现二级结构和引物二聚体，确保正向引物和反向引物具有相似的退火温度，确保引物的GC含量在20-80%，这对用SYBR Green分析尽量减少非特异性扩增非常重要；

2.标准样品最好为待测目标DNA克隆后的质粒，经酶切为线性DNA，需要纯化，测定浓度，计算拷贝数，制备好稀释梯度的DNA样品，稀释的好坏直接影响标准曲线的质量，也就直接影响定量结果的可靠性； 3.操作过程要十分小心，避免分装到八联管时发生污染； 4.设定阴性对照。

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