拉曼光谱在生物化学中应用

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拉曼光谱在生物化学中的应用

张文静

拉曼光谱是一种散射光谱。在30年代，拉曼散射光谱曾是研究分子结构的主要手段。自1960年激光问世并将这种新型光源引入拉曼光谱后，拉曼光谱的弱点（主要是拉曼效应太弱）被攻克。拉曼光谱出现了崭新的局面。目前激光拉曼光谱已广泛应用于有机、无机、高分子、生物、环保等各个领域，成为重要的分析工具。它不仅与红外光谱相配合，可以更完整地研究分子的振动和转动能级，更好地解决有机结构的分析问题。而且由于它的一些特点，如水和玻璃的散射光谱极弱，因而在水溶液、气体、同位素、单晶等方面的应用具有突出的特长。近几年来又发展了傅里叶变换拉曼光谱仪、表面增强拉曼光谱仪、超拉曼、共振拉曼、时间分辨拉曼等新技术，激光拉曼光谱在高分子结构研究中的作用正在与日俱增。

作为生物化学主要研究对象的生物大分子多是处在水溶液环境中，研究它们在水溶液中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系是很重要的。目前关于水溶液中生物大分子的结构（构性，构象）资料还比较少。生物大分子溶于水时结构上是否会发生变化？pH、离子强度、温度和溶剂等环境条件对生物大分子的结构会有什么影响？这些问题都有待我们去研究。由于水的红外吸收很强，因此用红外光谱发研究生物体系有很大局限性，而水的拉曼散射很弱，干扰小，而且拉曼效应对于分子构象的变化比较灵敏。此外，对生物大分子结构有重要影响的—S—S—键在红外光谱中吸收很弱，又处于低波数区（550~430ｃｍ-1），因而测定很困难，但它在拉曼光谱中却显示强峰。在激光拉曼光谱的测定中，样品用量很少，可低至数微克，这对生物化学体系也是非常重要的。由于上述原因，再加上激光拉曼光谱仪本身的不断改进，使激光拉曼光谱已成为一种能够快速，详尽提供有关水溶液中生物大分子结构信息的新技术。

生物大分子中，蛋白质、核酸、磷脂等是重要的生命基础物质，研究它们的结构、构象等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。应用激光拉曼光谱除能获得有关组分的信息外，更主要的是它能反应与正常生理条件（如水溶液，温度，酸碱度等）相似的情况下的生物大分子的结构变化信息，同时还能比较在各相中的结构差异，这是用其它仪器难以得到的成果。

多肽和蛋白质的分子链是同种或异种α－氨基酸头尾相连的肽链。这种酰胺键的振动状态有九种，如表1所示。其中酰胺Ａ，Ｂ常被ＣＨ伸缩振动和水分子振动所掩盖。酰胺Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ的拉曼线很弱，故它们都无应用价值。而酰胺Ⅰ的拉曼先强而宽，且为单线，对各种蛋白质分子差别不大，故参考价值不

大。酰胺Ⅲ很少受其它振动模式的干扰，且具有强拉曼效应，是分析鉴定结构的可靠模型。

表1 酰胺链的拉曼频率和归属 链 通常频率范围／ｃｍA ~３３００ Ｎ－Ｈ伸缩 酰胺Ｂ 酰胺Ⅰ 酰胺Ⅲ 酰胺Ⅴ 酰胺Ⅶ ~３１００ Ｎ－Ｈ伸缩（费米共振） １５９７~１５７５ Ｃ－Ｎ伸缩，Ｎ－Ｈ变形 １２２９~７６７ Ｏ＝Ｃ－Ｎ变形 ６４０~６０６ Ｃ＝Ｏ变形 ２００ Ｃ－Ｎ扭曲 多肽，蛋白质结构的拉曼信息是较丰富的。主链酰胺Ⅰ，Ⅲ特征振动能精确地描述它们的二级结构。许多的拉曼线归属与芳香环的氨基酸残基和Ｓ－Ｓ、Ｃ－Ｓ键振动的特征频率，它们的状态与蛋白质的几何构型和性能关系很为密切。多肽和蛋白质的二级结构是指主链构型为α－螺旋、β－褶板的不规则状或它们的混合态。利用酰胺基伸缩振动频率与二级结构关系通则，可以进行定量计算。 核糖核酸（ＲＮＡ）是磷酸与核糖相互连结并在核糖的１`位接上腺嘌呤（Ａ）、尿嘌呤（Ｕ）、鸟嘌呤（Ｇ）或胞嘧啶（Ｃ）等核酸碱基。去氧核酸（ＤＮＡ）在核糖的２`位上是ＣＨ２基，碱基由５－甲基尿嘧啶，即胸腺嘧啶（Ｔ）代替。在多聚的核酸链中，碱基相互排列组成了一级结构。二级结构通常指碱基相对与主链的方向位置以及碱基是由氢键配对或一个堆积在另一上面。核酸的二级结构包括有序和无序构型。核酸的主链状态发生变化可由－Ｏ－Ｐ－Ｏ－基拉曼线强度的变化来测定。根据实验－ＰＯ２?的对称伸缩振动（1100ｃｍ?1）不依赖于主链构型，将它作内标，求得814ｃｍ-1和1100ｃｍ-1谱线的强度比，能定量的说明有序（分子呈螺旋状）和无序构型的程度，当强度比在1.64±0.04时为100%的有序型，当比值等于０时则为完全无序型。如大肠菌甲酰甲硫氨转

移核糖核酸在中性常温水溶液中的比值为1.37，它的二级结构中就含有84％的有序型，16％属无序型。

二级结构的内容还包括碱基成对还是堆积型。碱基的构型状态取决于环振动和氢键的变化。例如PolyA2PolyU在32°C时呈双股状，其碱基的成对拉曼线在1668cm-1。当加温至85°C，它离解为单股时，就出现了不成对的拉曼线1661 cm-1,这两条线的强度比能反映主链中A2U的成对程度。

拉曼光谱在引入激光光源及光电探测技术之后得到了迅速的发展。然而，人们仍常常为样品本身或样品中杂质的荧光干扰而困惑。80年代末期发展了傅里叶变换拉曼（FT-Raman）技术，这一技术能有效地消除荧光干扰。由于高聚物样品或其中杂质的干扰，普通激光拉曼只能检测其中一小部分样品。而引入

FT-Raman技术后，已能成功地检测80％以上的合成和天然高聚物，生物大分子及其它样品。

FT-Raman技术能避免荧光干扰，从而大大拓宽了Raman光谱的应用范围。FT-Raman采用1.064μm近红外区激光激发以抑制电子吸收,这样既阻止了样品的光分解又抑制了荧光的产生。同其它在拉曼光谱中减少荧光问题的方法相比，近红外激发的傅里叶变换拉曼谱的魅力在它的抑制荧光的能力，它的现场检测特性及它的对多种复杂样品的适用性。FT-Raman技术可大大提高光谱仪的测量精度。在分光扫描系统中，光谱测量精度主要由机械扫描精度决定，很难在长程扫描中保持0.5 cm-1以上的精度，两次扫描之间重复精度也差。在FT-Raman系统中，由于是干扰计量，以稳频He-Ne激光波长为标准，对拉曼位移的测量可达10-3 cm-1，并且重复性好。另外，FT-Raman光谱仪能消除瑞利谱线，瑞利谱线的存在所引起的噪音会影响整个拉曼谱图，使相对较弱的拉曼线变得模糊。FT-Raman光谱仪所具有的滤光系统能够消除瑞利谱线。

生物物质组成高度复杂，通常在可见及紫外区对激光照射产生强荧光。反射红外光谱法被广泛用来研究“Intact”生物物质，但它的光谱分辨率很差且受到生物组织中水的吸收干扰。拉曼光谱受水的影响很小，但在用它对眼睛晶状体及植物的研究时，都遇到严重的荧光干扰，相比而言，用近红外激发可以成功地得到这些生物物质的无荧光干扰的傅里叶变换拉曼光谱。

眼球晶状体中蛋白质含量较之身体其它器官都高大约占质量的33%，如此高的蛋白质含量对把光聚焦在视网膜上起很重要的作用。晶状体中蛋白质的物理化学排布对其透明性影响很大，由意外事件造成的晶状体不透明都可能导致视力模糊甚至全部失明。老年性白内障是人眼睛里最常见的疾病之一。作为一种非破坏性技术的拉曼光谱已被广泛地用来在分子水平上研究晶状体的病变结构变化。但对普通拉曼光谱来讲，老年人眼睛中色素沉淀的晶状体的荧光性物质是一个严

重的干扰问题。用FT-Raman光谱却可免受其害。

植物是由两种主要细胞构成：一组负责新陈代谢，另一组为非新陈代谢，负责输送液体或起支撑作用。细胞壁的存在是植物细胞区别与动物细胞的特征之一。细胞壁的主要组成是植物纤维物质和木质素。传统的研究植物细胞壁的方法需对其进行离析，这样就破坏了它的形态。FT-Raman技术可用来研究细胞壁。研究三种不同木质组织的光谱图，它们分别是南方松树、竹子和枸杞。在枸杞的近红外FT-Raman光谱图上标出了主要的拉曼位移：其中2898 cm-1和1098 cm-1的拉曼谱线是由植物纤维物质的单独振动产生；1655和1608 cm-1处的谱线是由木质素单独贡献的。同时在1455，1384，1339及905 cm-1处还可以检测到植物纤维物质和木质素的重叠模式。从这三种不同物质的光谱上可以看出：竹子的化学组成名显异与松树和枸杞。FT-Raman光谱技术既是一种可获得丰富信息又是一种实施方便的分析植物组织化学组成的先进技术。

综上所述，拉曼光谱（包括激光拉曼光谱和傅里叶变换拉曼光谱）是一种灵敏度高、不需特殊制样、不破坏样品并可对样品物质进行检测的崭新技术，随着激光技术、计算机技术等相关技术的不断地发展，拉曼光谱技术必将不断改进创新，将在生物化学中发挥更大的作用。 [参考书目]：

1. 薛奇 《高分子结构研究中的光谱方法》 高等教育出版社 1995年5月

2. 许存义 左健 《紫外拉曼散射及其应用》 《物理》 1999年 第28卷 第4期 万

方数字资源系统 数字化期刊

3. 孙志贤 《现代生物化学理论与研究技术》 军事医学科学出版社 1995年4月 4. 中国科学院科技政策局《走向21世纪的生物学未来生物学（1991~2020年）预测》

华夏出版社 1992年4月

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红外与拉曼光谱在生物学中的应用

09811031 生化系 曹建

结构化学是研究原子、分子和晶体的微观结构，研究原子和分子的运动规律，研究物质的结构和性能关系的科学，是化学的一个重要分支。它包含许多有用的概念和知识，许多重要的规律和原理，并且发展和改进许多研究方法和实验手段。同时随着生物学进入分子生物学时代，对于一个生物科学工作者来说，对结构化学知识的了解已经成为不可缺少的了。以下我将通过对光谱技术中红外与拉曼光谱的学习和了解，表达我对本学科的一些认识和看法。

数十年来化学家已经利用光谱技术来研究化合物的结构和反应，这些技术的主要优点是它们一般不会损伤所研究的分子，并且容易精确化和自动化，这些优点对于生物学家也是重要的。在有机结构的分析中，红外光谱与拉曼光谱是相互补充的。红外光谱谱图解析主要是在掌握影响振动频率的因素及各类化合物的红外特征吸收谱带的基础上，按峰区分析，指出某谱带可能属于哪个峰区，结合其它峰区的相关峰，确定其归属。在此基础上，再仔细归属指纹区的有关谱带，综合分析，提出化合物的可能结构。必要时查阅标准图谱或与其它谱（1H NMR，13C NMR，MS）配合，确证其结构。与其它谱比较，红外光谱谱图的解析更具有经验性、灵活性。而在拉曼光谱中，谱带频率与功能团之间的关系与红外光谱基本一致。不同的是有些功能团的振动，在红外光谱中能观测到，在拉曼光谱中很弱甚至不出现；而另一些基团的振动，红外光谱中很弱甚至不出现，在拉曼光谱中则可能是强带，这是由于两者的选律不同，所以在有机结构分析中，两者可以相互补充。在拉曼光谱中，振动谱带的叠加效应较小，谱带清晰，对整个分子的骨架振动的表示比较有特征性。另外，拉曼光谱还可以测定分子的退偏度比，利于弄清分子的对称性等。 一、红外光谱的应用

纯的转动光谱发生在微波区，其能量较低，对生物大分子的研究价值不大。一个生物大分子中有数目巨大的振动模式，完全的红外光谱非常复杂。但是人们在总结大量红外光谱实验资料的基础上，发现在不同的化合物中，同一种化学键或基团，往往表现出大致相同的吸收峰位置，这些就是我们常利用的特征振动频率，它可以帮助我们判断有无某种化学键或基团，从而帮助判断分子结构。 例如在研究血液中存在的胆固醇时，有时需区分自由胆固醇和被脂肪化的胆固醇，此时可利用两分子的红外光谱加以区别：

自由胆固醇的红外光谱应有OH基吸收峰而无羰基吸收峰。它的脂化产物恰相反。我们在课堂上了解到 OH吸收峰在3500cm-1附近而羰基吸收峰在1700cm-1附近。这样我们可以根据这两者的谱图，发现其中一谱图在1730cm-1附近有强吸收，因而可判断为被脂肪化了的胆固醇（原图为胆固醇醋酸脂与自由胆固醇，此处未标出）。

以上只是红外光谱在鉴别上的部分应用，其对于化合物的性质测定也有一定的价值。以下是一个近期在报刊上发表的例子。

近年来，有关天蚕的饲育、基础理论和开发利用等研究备受关注。几位科学工作者用红外光谱法测定了桑蚕茧、柞蚕茧、龙蚝天蚕茧、东北天蚕茧和河南天蚕茧丝蛋白结构，其谱图及研究结论如下：

由谱图1-5和谱图6可见，被测定蚕茧样品均为丝蛋白结构。根据蛋白质特征吸收峰的归属可知，3300cm-1谱峰为酰胺 A NH伸缩振动和OH伸缩振动，

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