植物原生质体培养

原生质体的培养

1. 原生质体的分离与纯化

原生质体培养的意义

(1)再生植株 由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。

原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。

(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。

一、原生质体(protoplast)的分离

（一）材料来源

原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有\全能性\，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。

（二）分离方法 1.机械分离法

1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体.

2.酶法分离 (1)酶的种类及特点

构成植物细胞壁的三个主要成分是：

① 纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。 ② 半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。

③ 果胶酶类：一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素

酶和果胶酶。

④ 崩溃酶：一种粗制酶

⑤ 蜗牛酶：主要用于分离小孢子的原生质体。

纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C1，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶Cx，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。

果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。

ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶(包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等)，果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。

日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。

(2)酶液的配制

①酶的配比及浓度(见表7-1)。 ②渗透稳定剂及pH。

植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。

因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40～0.80mol／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。

酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5.0时， 原生质体产生得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6.0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。

(3)分离原生质体 ①两步分离法 ②一步分离法

分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。

酶处理目前常用的多是\一步法\，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液10～30ml不等。

由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细胞的原生质体的酶液中须加入0.55mol／L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加0.4～0.45mol／L的甘露醇，两者差别较大。

酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。

酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在40～50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃左右进行酶解。

若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0.53％次氯酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。把4g叶组织置于含有200ml不加蔗糖和琼脂的培养基500ml三角瓶中。在4℃黑暗条件下培养16～24h，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5.6，通常在酶液中使用的等渗剂为0.55～0.6mol甘露醇。然后，酶液真空渗入叶片组织。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放人10ml的酶液中(3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5.0～6.0)，在25～33℃条件下酶解24h。原生质体-酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。

在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。

二、原生质体的纯化和活力测定 （一）原生质体的纯化 1.离心沉淀法

在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生质体。

原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：

（1)将原生质体混合液经筛孔大小为40-100／tm的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。

（2)将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管谨慎地吸去上清液。

（3)将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外，其他成分和酶液相同)，再次离心，去上清液，如此重复三次。

（4)用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。一般原生质体的培养密度为104-106／ml。

2.漂浮法

应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。 3.界面法

选用两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体密度，一种溶液的密度小于原生质体密度。 （二）原生质提活力的测定 1.形态识别

形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。 2.染色识别

在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。测定原生质体活性有多种方法，如观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯(FDA)染色等。这些方法各有特点，但现在一般用的是FDA染色法。FDA本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质体膜。一旦进入原生质体后，由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荧光，而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。FDA染色测活性的方法如下：

取洗涤过的原生质体悬浮液0.5ml，置于10×100mm的小试管中，加入FDA溶液使其最终浓度为0.01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荧光的为无活力的。由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。

2. 原生质体培养

将有生活力的原生质体在适当的培养基和培养条件下培养，很快就开始出现细胞壁再生和细胞分裂的过程。约1～2个月后，通过细胞的持续分裂，在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导芽和根长成完整的植株。 一、培养基

1.碳源 2.氮源 3.生长物质 4.钙镁 5.渗透压 6.pH及灭菌 二、培养方法

1.液体浅层培养

液体培养法是在培养基中不加凝胶剂，原生质体悬浮在液体培养基中，常用的是液体浅层培养法，即含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。这种方法操作简便，对原生质体伤害较小，日便于添加培养基和转移培养物，是目前原生质体培养工作中广泛应用的方法之一。其缺点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易造成局部密度过高或原生质互相粘连而影响进一步的生长发育．并且难以定点观察，很难监视单个原生质体的发育过程。

在固体培养法中提到的饲养培养和共培养，也可以用于液体培养的方法。

微滴培养法是液体培养的一种方式。将悬浮有原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴接种在无菌且清洁干燥的培养皿卜．由于表面张力的作用，小滴以半球型保持在培养皿表面，然后用Paratilm封口，防止干燥和污染。如果把培养皿翻转过来，则成为悬滴培养。由于小滴的体积小，在一个培养皿中可以做很多种培养基的对照实验。如果其中一滴或几滴发生污染，也不会殃及整个实验。同时也容易添加新鲜培养基。其缺点也是原生质体分布不均匀，容易集中在小滴中央。此外由于液滴与空气接触面大，液体容易蒸发，造成培养基成分浓度的提高。解决蒸发问题最简单的办法就是在液滴上覆盖矿物油。

有些研究工作需要进行单个原生质体培养。如选择出特定的原生质体和经融合处理后数量很少的融合体等。已有实验证实，单个原生质体的单独培养的关键在于培养基原体积要特别小。如油菜单个的原生质体须培养在50ml的培养基中，这种比例相当于每毫升培养基有2X104个原生质体，在这种条件下，原生质体的再生细胞可以持续分裂直到形成愈伤组织。这样小体积的微滴，是极易蒸发的，为此，Koopt设计了一个特殊的装置：首先，在一个长度为3350um。并绝对洁净的盖玻片上滴50滴2.0mol／L蔗糖小滴，每滴1ul，分布成10行，每行的距离为3.4um。然后把盖玻片在硅溶液中浸一下，使得蔗糖小滴占领的圆点外的全部盖玻片被硅化。硅化的目的是防止以后的矿物油滴相互连通。硅化后，用水小心地把蔗糖液滴洗去，然后使盖玻片干燥并灭菌。在原来蔗糖液滴占领的圆点区域加上1um的矿物油滴，再把已悬浮有原生质体的培养液用注射器注到矿物油滴中。这样制备好的盖玻片放到一个双环培养皿中，培养皿的外环加满0.2mol／L的甘露醇溶液，最后封口。由于有矿物油并且盖玻片相当于保持在一个湿润的小室中，保证了微小培养基不会蒸发，从而可以达到单个原生质体培养的目的。

2.平板法培养

取1ml原生质体密度为4×105/ml悬浮液，与等体积已溶解的含有1.4%低熔点（40℃）琼脂糖的培养基均匀混合后，置于直径为6cm培养皿中，此时密度为2×10/ml，待凝固后，将培养皿翻转，置于四周垫有保湿材料的直径为9cm培养皿内

3.悬滴法培养

将含有一定密度原生质的悬浮液，用滴管或定量加液器，滴在培养皿的内侧上，一般直径为6cm培养皿盖滴6～7滴，皿底加入培养液或渗透剂等液体以保湿，轻而快的将皿盖盖在培养皿上，此时培养小滴悬挂在皿盖内

4.双层培养法

为固体培养和液体培养想结合的方法 5.饲喂层培养

培养方法是将饲喂层的细胞用培养基制作平板，此平板即“饲喂层” 三、培养条件

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