CTBA,SDS,高盐低提取液配方和方法

2×CTAB提取液（pH 8.0）：2％（w/v）CTAB，1.4 M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HC1，0.2%巯基乙醇（v/v）

即称取CTAB 2 g，加蒸馏水40mL，加1 M Tris-HCl（pH 8.0）10mL、0.5 M EDTA（pH 8.0）4mL和5 M NaCl 28mL，2ml巯基乙醇待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100mL。

1) 1M Tris-HC1（pH 8.0）：在800mL水中溶解121g Tris碱，用浓HC1调节pH至所需值pH 8.0（约42mL HC1），加水定容1000mL，分装后高压灭菌。 2）0.5M EDTA（pH 8.0）：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2·2H2O），搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0（约10g NaOH颗粒），定容至500mL，高压灭菌。 3）5 M NaCl：称取292.2 g NaCl，用双蒸水定容到1000mL，高压灭菌备用。 TE缓冲液配方

TE的组成浓度为：10mM Tris-HCl ；1mM EDTA PH=8.0，配制过程如下： 量取下列溶液于500ml烧杯中

1M Tris-HCl Buffer PH=8. 0 5ml 0.5M EDTA PH=8.0 1ml SDS配方

100mM Tris-HCl(pH8.0) 100mM NaCl

50mM EDTA（pH8.0） 2% SDS

即加1 M Tris-HCl（pH 8.0）10mL、0.5 M EDTA（pH 8.0）10mL和

5 M NaCl 2mL

氯仿：异戊醇=24：1（v/v）

78.95ml 95%乙醇+21.05ml水=100ml 75%乙醇 高盐低pH成分

组成：100 mmol/L醋酸钠,50 mmol/L EDTA, 500 mmol/L氯化钠, 3%SDS, 1%β-巯基乙醇,pH5.

5MNaCl 10ml+0.5MEDTA 10ml+1M醋酸钠 10ml+3g SDS+1ml硫基乙醇 最后定容至100ml。 醋酸钾 2.5M 醋酸钠 1M

在开展DNA提取工作前,需要完成4方面的准备工作:①水浴锅温度升至65℃，②将提取缓冲液置于水浴锅中预热;③在冰箱中预冷异丙醇和24：1的氯仿：异戊醇混合液;

CTAB法

(1) 称取1. 0 g的龙葵叶片,搁置于研钵中,加入约30 mL的液氮,轻轻捣碎叶片,等液氮快挥发完时,快速研磨到粉状(越细越好),把粉末转移到有标记的2mL无菌离心管中。此步操作应戴手套,防止皮肤冻伤。（2)加入650ul预热的DNA提取缓冲液,用力振荡1~2 min,上放入65℃水浴锅中保温45 min以上,其间,每隔15 min用手轻微振荡3或4

次。(3)从水浴锅中取出样品管,加入650ul预冷的24：1的氯仿：异戊醇,盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动5~10 min。(4)在10 000 r/min下离心10 min。(5)用移液枪缓慢吸取上层清液约500~700ul到做好标记的1. 5 mL离心管中。此步操作应非常小心,注意不要吸得过多、过快,避免振荡,以免造成蛋白质污染;如果离心层因振荡引起上清液浑浊,将影响提取效果,此时须要再离心。(6)在获得的上清液中加入预冷的异丙醇,加入量按吸取上清液体积的2 /3计,约330~470ul。轻轻上下摇动离心管,注意观察DNA将从溶液中析出。如溶液中DNA含量较少,将会观察到管中含有白色悬浮的DNA颗粒;如样品中DNA含量较高,则可观察到白色絮丝状的DNA悬浮于溶液中。(7)马上在8 000 r/min条件下离心5 min,继续提取DNA。(8)离心后,小心倒掉上清液,用纸吸去管壁处多余的溶液,保留DNA沉淀于管底。(9)加入70%乙醇600ul洗涤沉淀,振荡起沉淀数秒钟, 5 000 r/min条件下离心去上清液。再重复步骤(9)洗涤沉淀1次。(10)室温下干燥DNA沉淀,在见到无色胶状物附在管壁时,加入150ul的TE缓冲液溶解沉淀的DNA。 SDS法

①取龙葵叶片1.0克研磨,加入约30 mL的液氮,轻轻捣碎叶片,等液氮快挥发完时,快速研磨到粉状(越细越好),把粉末转移到有标记的2mL无菌离心管中。②随后放入含650ul缓冲液的离心管中(65℃的水浴中预热)。65℃水浴锅中保温45 min以上,其间,每隔15 min用手轻微振

荡3或4次。③从水浴锅拿出样品管后，加650ul的1：1的酚/氯仿溶液,盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动5~10 min,④10 000 r/min下离心10 min,⑤取上清液500~700ul转入新的1.5 ml管中。加650ul的氯仿溶液,充分混合,重复抽提一次;加入量按吸取上清液体积的2 /3计,约330~470ul异丙醇并上下轻轻混匀;(7)马上在8 000 r/min条件下离心5 min,继续提取DNA。(8)离心后,小心倒掉上清液,用纸吸去管壁处多余的溶液,保留DNA沉淀于管底。(9)加入70%乙醇600ul洗涤沉淀,振荡起沉淀数秒钟, 5 000 r/min条件下离心去上清液。再重复步骤(9)洗涤沉淀1次，沉淀加150ul的TE缓冲液溶解,置-4℃冰箱中保存备用。

高盐低pH值法

①取1.0g新鲜叶片(龙葵)置液态氮中研磨成粉,装于1支1.5mL离心管中。②迅速加入预热至65℃的1mL的提取缓冲液，于65℃的恒温振荡器温育30min。③10000r/min离心10min。④吸取上清液加入2/3倍体积的2.5mol/L KAC(pH 4.8), 0℃下放置30min, 10000r/min离心10min。⑤吸上清液移入另一支离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)反复颠倒混匀,10000r/min离心10min反复抽提至中间无白色沉淀。⑥上清液加入0.6倍体积-20℃异丙醇,轻轻混匀置-20℃沉淀1h。⑦8000r/min离心15min,所得沉淀用70%乙醇洗2~3次,待残留的乙醇挥发后,将DNA溶于150ul TE缓冲液中,置-20℃冰箱中保存备用。

NaOH法

①取1.0 g龙葵叶剪碎于研钵中，加0.25mol／L NaOH 5 ml，研磨，将研磨液转移至纯净的小烧杯内，将小烧杯置于沸水中2min之后加

入3 ml 0.25 mol／L HCl中和，再加5ml 0.5 mol／L Tris．HCI(pH值8.0)，沸水浴5min ②将离心管放于65℃的水浴锅中水浴30 min；③再将等体积的氯仿：异戊醇(24：1)溶液加入离心管中，摇匀，使之成乳状液，12 000 r／min离心5 min；④用移液枪吸取上清液并转入另一离心管中，加等体积的氯仿．混匀，12 000 r／min离心5 min；⑤将上清液转入另一无菌离心管中，加2倍体积预冷的异丙醇，温和倒转数次，出现絮状DNA沉淀后用吸管将其吸出，放入另一无菌离心管中,马上用8000r/min离心15min；⑥用75％乙醇冲洗DNA 多次，小心倒去液体相，风干，用150ulTE溶液溶解，一20℃保存备用。

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库CTBA,SDS,高盐低提取液配方和方法在线全文阅读。