总RNA的提取定量与RT-PCR(2)

（6）于70℃加热15 min以终止反应，将管插入冰中。

3．PCR：[本次实验采用Premix Taq Version2.0(Loading dye mix)试剂]

（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl 、上游引物（10pmol/L）2 μl 、下游引物（10pmol/L）2 μl 、dNTP(2mmol/L) 4 μl 、10×PCR buffer 5 μl 、Taq酶（2U/μl） 1 μl 。 （2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心。

（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G-3-PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。 （4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （5）结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。

四、实验注意事项

1、本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。

2、快速的操作，低温环境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。

3、加样原则是酶最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。

南医实验报告

【实验记录】 一、 实验条件

见第一、第二部分。 二、 实验现象

1、 琼脂糖凝胶电泳图像：

从凝胶电泳的图像上看，本组的反转录DNA条带可以看到与MARKER带对应的特异性条带，但特异性不明显，也出现了弥散或非特异性条带。

南医实验报告

【结果与讨论】

一、结果 如上图所示。 三、

讨论

（1）特异性反转录DNA条带不明显, 且有弥散或非特异性条带，说明在总RNA的提取上存在缺陷，导致RNA提取量不足且反转录产生其他DNA片段。 具体原因可能包括 1）

多种原因导致RNA降解或断裂，如操作时间过长，存在污染物，实验中

保存温度过高，溶液或离心管未经RNase去除处理，细胞在用酶处理时过度等 2） 3） 4）

细胞裂解不充分，RNA提取量不足 吸取RNA上清液时存在少量DNA杂质 RNA提取时未完全溶解，导致RNA量不足

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