人体口腔微生物宏基因组的研究进展(2)

1977年Sanger等[8]发明了双脱氧核苷酸末端终止测序法，经过不断改进，迅速成为第一代测序技术的主流，帮助学者完成了从病毒到人体基因组的测序工作。然而传统的Sanger法由于通量低、速度慢、成本高，不能完全满足后基因组时代科研的需求。2006年后第二代测序技术陆续诞生，第二代测序技术以合成测序为核心思想[9]，通过采集解析新合成端的荧光信号确定核酸序列。第二代测序主要有Roche、Illumina、ABI和HelicosBiosciences4家公司的平台，且各具特点。Roche、Illumina均使用DNA聚合酶测序，Roche平台的优势在于有效序列读长可以达到400～500bp，可以有效覆盖16/18SrDNA、内转录间隔区（internaltranscribedspacer，ITS）可变区，得到对微生物多样性、群落结构、种系关系精确的解析；

Illumina平台总测序量大，测序成本只有Roche的1/10，但有效序列读长短，常用于鸟枪法测序后将序列与功能基因进行匹配，研究微生物群落功能信息。ABISOLiD的独特之处在于双碱基编码（twobaseencoding）的DNA连接酶测序[10]，即每种荧光信号与4种碱基对绑定，且每个位置测定两次，这样的纠错设计让ABISOLiD成为第二代测序平台中最为准确的。HeliScope测序不需要对DNA进行扩增，避免聚合酶链反应（po-lymerasechainreaction，PCR）引起的偏倚，首次实现了单分子测序和RNA直接测序，但是HeliScope和SOLiD技术用于微生物组学却鲜有报道。第三、四代测序平台不依赖荧光检测系统或化学洗脱过程[11]，目前尚在研发中。

基因芯片和第二代测序是对传统技术的革新，突出优点在于：物种检测范围广，可检测正常存在的低丰度甚至痕量物种；研究定量化，序列读取杂交信号强度可以反映物种丰度信息；高通量研究，单次检测就可获得大量生物信息，第二代测序还有核酸条码同时标记和测定多个样品。另外Ahn等[12]同时用Roche二代测序和人类口腔微生物鉴定芯片研究了口腔微生物组，发现两种技术检测菌群多样性和丰度具有良好的一致性和相关性。但是二者又各具特点，基因芯片是封闭结构，只能检测已知的序列，探针设计、芯片制作复杂，但是后续“模拟”数据处理相对容易，可用于已知微生物群落的常规研究，且费用较低。第二代测序是开放结构，优势在于可以寻找发现新的生物信息，待测样品制备容易，但是“数字”数据提取处理复杂，费用较高，主要用于未知环境微生物群落结构、生态功能的深度研究，因此应根据不同的研究需要合理选择。2

口腔微生物宏基因组

口腔是人体微生物定植生存的重要生态区，口腔微生物不仅有细菌，还包括真菌、病毒、螺旋体及古细菌等。口腔多层次多位点的微生态区定植着显著不同的微生物群落。目前NIH正在进行健康成人微生物组研究，招募了300名受试者，采集每个个体呼吸道、口腔、皮肤、肠道、阴道微生物样品，其中口腔的采集位点包括附着龈、硬腭、咽喉、腭扁桃、舌背、颊黏膜、龈上菌斑、龈下菌斑、唾液，占全身18个采集位点的9个[13]。Dewhirst等[14]甚至认为口腔相毗连的部位，如扁桃体、咽、食道、耳咽管、中耳、气管、肺、鼻腔、鼻窦等中的微生物也属于口腔微生物组的范围。目前基于第二代测序技术的宏基因组学研究已经从整体上揭示了健康人体口腔微生物组的生物多样性，以及口腔微生物组的

人体口腔微生物宏基因组的研究进展

华西口腔医学杂志第31卷第1期2013年2月

WestChinaJournalofStomatologyVol．31No.1Feb.2013http：//

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稳定与变化。

2008年美国福赛斯研究所和英国国王学院联合在NIH牙颅颌面研究所（NationalInstituteofDental

andCraniofacialResearch，NIDCR）建立了人类口腔微生物组数据库（humanoralmicrobiomedatabase，

[15]

HOMD）。目前HOMD中详细记录了13门619种口腔微生物分类群的系统发育树、16SrRNA及基因组的信息。这13门分别是：放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、衣原体门（Chlamydiae）、绿弯菌门（Chloroflexi）、广古菌门（Euryarchaeota）、厚壁菌（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）、SR1、互养菌门（Synergistetes）、柔膜菌门（Tenericutes）和TM7。其中65.6%的微生物已被培养，约290种细菌菌种已被培养和正式命名[14]。Dewhirst等[14]进一步研究认为口腔微生物谱共包括1179个种系型，其中有24%已被命名，8%已被培养但未命名，68%未培养。Zaura等[16]研究发现平均每个个体的口腔中共有266个系统发育型。Keijser等[17]甚至发现口腔微生物涵盖22个门318属，其中唾液185属，菌斑267属，唾液和菌斑分别有5600、10000个种系型，并发现了与参考序列差异10%的新5305个新种系型。Nasidze等[18]发现唾液微生物涵盖了101个已知细菌属，其中39个属首次在口腔中发现，另外还发现了64个未知细菌属。这些研究结果不尽相同，与取样部位和方法、个体差异、样本制备、引物选择、16SrRNA可变区间的差异、操作分类单元（operationaltaxonomicunits，OTU）设值等有关，但这些结果提示以往的研究远远低估了庞大的口腔微生物谱。

Costello等[19]测序了9个健康人全身27个部位、4个时间点的微生物群落，发现人体的不同部位微生物群落构成有着显著差异，有特征性的微生物组，其中口腔和肠道有着最有特征的微生物组。不同个体同一部位的微生物群落显示一定的个体间差异，而个体内微生物组构成随时间的差异最小。与人体其他部位相比，口腔的微生物组显示了最小的个体内时间依赖性和个体间的变异。Bik等[20]的研究也证实口腔微生物组与人体其他部位微生物组构成显著不同，且至少有15个细菌属在不同个人之间保守存在，但在菌种和菌株水平有显著的个体间差异。Nasidze等[18]分析了5个洲人群的唾液样本，发现口腔微生物组构成有着个体内和个体间的差异，个体间的差异与不同的地区来源没有关系。Zaura等[16]测序了3个健康个体口腔牙面、颊、硬腭、舌、唾液5个部位的微生物组，发现牙齿邻面微生物多样性最高，颊部微生物多样性最低，主成分分析可以区分牙表面和软

组织表面的微生物群落。3个个体的微生物组构成有较大的重叠，占66%测序内容的1660个序列在3个个体间共同存在。Crielaard等[21]发现随着儿童年龄逐渐增长，口腔中普氏菌、韦荣氏球菌、螺旋体和TM7所占比例逐渐升高，反映了微生物组随着儿童生长发育的逐渐成熟过程。这些研究提示口腔微生物组生物多样性构成与人体其他部位显著不同，口腔微生物组有着个体间以及个体内时间、空间依赖性的差异，但这种差异与全身其他部位相比较小，提示口腔可能存在有更大的核心微生物组。

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