尿囊液病毒RNA的提取

尿囊液病毒RNA的提取及反转录

1、目的及适用范围：

该SOP主要用于尿囊液病毒中RNA的提取，以获得所需病毒RNA，然后经过反转录后得到病毒的cDNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern,RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。其原理是利用Trizol（主要成分是异硫氰酸胍和苯酚）能破坏细胞，使RNA释放同时保持RNA的完整性的特性使RNA被释放，然后加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，再通过异丙醇沉淀来还原RNA。 2、主要仪器及试剂

离心机、Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC水，75%酒精（DEPC水配制）、RNA free枪头 3、操作步骤

3.1 取尿囊液病毒250ul置于RNA free的EP管中，然后加入750ul预冷的Trizol，震荡器剧烈震荡15s，于室温下，静置5min；

3.2 加入300ul氯仿，剧烈震荡15s后，于室温下，静置3min； 3.3 将EP管放入预冷的离心机中，4℃,12000rpm离心15min；

3.4 取上层（500-700ul，一般取600ul）置于另一新的RNA free的EP管中，加入600ul的异丙醇，上下颠倒轻轻混匀，于室温下，静置10min；（所取上层溶液的量与异丙醇的量的比例为1:1）；

3.5将EP管放入预冷的离心机中，4℃,12000rpm离心10min；

3.6 弃上清，每管中中加入1ml75%的乙醇洗涤RNA沉淀（可轻轻上下颠倒或用枪轻轻吹吸），然后将EP管放入预冷的离心机中，4℃,12000rpm离心10min； 3.7 弃上清，室温下晾干，一般为20min左右。

3.8 每管加入30ul DEPC水溶解RNA沉淀（用枪轻轻混匀），可立即用于反转录，或－80℃冻存。 3.8 反转录体系及条件 （以25ul反应体系为例）：

RNA 样品 14ul

10mM dNTPS 2ul 随机引物（或特异性上、下游引物或流感Uni12）各或 1ul. 5×MLV Buffer 5ul RRI（RNA酶抑制剂） 1ul MLV（反转录酶） 1ul DTT（0.1M） 1ul 反转录条件为：42℃×59min，80℃×5min，4℃＋∞。 4、注意事项

4.1 所用试剂需RNA专用，并在RNA提取专用操作区操作。 4.2 操作人员需带上口罩，操作过程中尽量不要说话。 4.3 反转录酶也可用AMV等；引物也可用随机引物；

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