DNA重组技术(2)

①粘性末端连接，每一种限制性核酸内切酶作用于DNA分子上的特定的识别顺序，许多酶作用的结果产生具有粘性末端的两个DNA片段。

②平整末端连接，某些限制性内切酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端。

③同聚末端连接，在脱氧核苷酸转移酶（也称末端转移酶）的作用下可以在DNA的3′羧基端合成低聚多核苷酸。如果把所需要的DNA片段接上低聚腺嘌呤核苷酸，而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸，那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过DNA连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接。

④人工接头分子连接，在两个平整末端DNA片段的一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段，这里面包含有某一限制酶的识别位点。经这一限制酶处理便可以得到具有粘性末端的两个DNA片段，进一步便可以用DNA连接酶把这样两个DNA分子连接起来。

2.2导入宿主细胞

将连接有所需要的DNA的载体导入宿主细胞的常用方法有四种： ①转化，用质粒作载体所常用的方法。

②转染（见转化），用噬菌体DNA作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。

③转导，用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。 ④注射，如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入

2.3选择

用以上任何一种方法连接起来的DNA中既可能包括所需要的DNA片段，也可能包括并不需要的片段，甚至包括互相连接起来的载体分子的聚合体。所以接受这些DNA的宿主细胞中间只有一小部分是真正含有所需要的基因的。 一般通过3种方法可以取得所需要的宿主细胞：

①遗传学方法，对于带有抗药性基因的质粒来讲，从被转化细菌是否由敏感状态变为抗药的状态就可以知道它有没有获得这一抗药性质粒。一个抗药性基因中间如果接上了一段外来的

DNA片段，就使获得这一质粒的细菌不再表现抗性。

把一个带有两个抗性基因氨苄青霉素抗性和四环素抗性的质粒pBR322用限制酶Bam HI处理，由于Bam HI的唯一的识别位点是在四环素抗性基因中，所以经同一种酶处理的DNA分子片段就可以连接在这一基因中间。在被转化的细菌中选择只对氨苄青霉素具有抗性而对四环素不具抗性的细菌，便可以获得带有外来DNA片段的载体的细菌。这是一种常用的遗传学方法。

②免疫学方法和分子杂交方法，当一个宿主细胞获得了携带在载体上的基因后，细胞中往往就出现这一基因所编码的蛋白质，用免疫学方法可以检出这种细胞。分子杂交的原理和方法同样可以用来检测这一基因的存在（见分子杂交、基因文库）。

2.4基因表达

在构建重组体DNA分子和选择宿主细胞时，还须考虑外源基因表达的问题。就是说要求外来的基因在宿主细胞中能准确地转录和翻译，所产生的蛋白质在宿主细胞中不被分解，而且最好还能分泌到细胞外。为了使外源基因表达，需要在基因编码顺序的5′端有能被宿主细胞识别的启动基因顺序以及核糖体的结合顺序。

两种常用的方法能用来使外源基因在宿主细胞中顺利地表达：

①在形成重组体DNA分子时在载体的启动基因顺序和核糖体结合顺序后面的适当位置上连接外源基因。例如将兔的β-珠蛋白基因或人的成纤维细胞干扰素基因分别连接到已经处在载体上的大肠杆菌乳糖操纵子的启动基因后面，便能使它们在大肠杆菌中顺利地表达； ②将外源基因插入到载体的结构基因中的适当位置上，转录和翻译的结果将产生一个融合蛋白。这种融合蛋白质被提纯后，还要准确地将两部分分开，才能获得所需要的蛋白质。在早期的遗传工程研究中，生长激素释放抑制因子和鼠胰岛素基因的表达都是通过将它们连接在β-半乳糖苷酶基因中的方式实现的。

3、DNA重组技术的应用

3.1医药行业

包括活性多肽、蛋白质和疫苗的生产，疾病发生机理、诊断和治疗新基因的分离以及环境监测与净化。胰岛素、人的生长激素、人的胸腺激素α-1、人的干扰素、牛的生长激素、乙型

肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原等在基因重组技术中的应用大大促进了医学的发展。

3.2发酵工业

用大肠杆菌生产人的生长激素释放抑制因子是第一个成功的实例。在9升细菌培养液中这种激素的产量等于从大约50万头羊的脑中提取得到的量。这是把人工合成的基因连接到小型多拷贝质粒pBR322上，并利用乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因的高效率启动子，构成新的杂种质粒而实现的。利用遗传工程手段还可以提高微生物本身所产生的酶的产量。例如可以把大肠杆菌连接酶的产量提高500倍。

3.3动植物育种和基因治疗

已经有一些研究工作明确地预示着重组DNA技术在这些方面的潜力。例如把来自兔的β-血红蛋白基因注射到小鼠受精卵的核内，再将这种受精卵放回到小鼠输卵管内使它发育，在生下来的小鼠的肝细胞中发现有兔的β-血红蛋白。还有人把包括小鼠的金属巯基组氨酸三甲基内盐I基因的启动子及大鼠生长激素结构基因的DNA片段注射进小鼠受精卵的前核中，由此发育得来的一部分小鼠由于带有可表达的大鼠生长激素基因，所以明显地比对照鼠长得大。这些实验结果为基因治疗展现了可喜的前景。固氮的功能涉及17个基因，分属7个操纵子，现在已能把它们全部引入酵母菌，而且能正常地复制，不过还没有能使这些基因表达。改造玉米胚乳蛋白质而使人畜营养必需的赖氨酸和色氨酸成分增加的工作也在着手进行。大豆的基因已能通过Ti质粒引入向日葵。因此，可以预期随着时间的推移在能源、农业、食品生产、工业化学和药品制造等方面都将会取得巨大的成果。

4.1DNA重组技术的生物安全

生物表达系统由载体和宿主细胞组成。必须满足许多标准使其能有效、安全地使用。下列情况需要较高的生物安全水平：

1、来源于病原生物体的DNA序列的表达可能增加GMO的毒性。

2、插入的DNA序列性质不确定，例如在制备病原微生物基因组DNA库的过程中。 3、基因产物具有潜在的药理学活性。 4、毒素的基因产物编码。

5、5、病毒载体（腺病毒载体）可以用于将基因有效地转移到其他细胞。这些载体操作时

应采用与用于获得这些载体的母体腺病毒相同的生物安全水平。携带外源性遗传信息的动物（转基因动物）应当在适合外源性基因产物特性的防护水平下进行操作。特定基因被有目的地删除的动物（“基因敲除”动物）一般不表现特殊的生物危害。

6、那些表达了能够耐受除草剂或抵抗昆虫能力等基因的转基因植物，在世界许多地区都引起相当的争议。这些争议的焦点是这类植物作为食物的安全性，以及种植后的长期生态后果。表达动物或人源性基因的转基因植物用于研发医学产品和营养物品。通过危险度评估可以确定这些转基因植物产品所需的生物安全水平。

5结语：随着科学技术的不断发展，各个学科，各个领域研究发面的相互交

叉、相互作用，生物学也去的了巨大的成就和进步。已成为带头学科之一，而其中的DNA重组技术也不断地完善、发展、进步，已为现代生物学领域做出了极大的贡献。并也将为人类的进步再添助力！

参考文献：朱玉贤，李毅，郑晓峰编著。现代分子生物学。第三版，北京：

高等教育出版社，2007

吴乃虎编著，基因工程原理。第二版，北京：科学出版社，2001

瞿礼嘉，顾红雅，胡苹，陈章良编著。现代生物技术。北京：高等教育出版社，2004

张红卫，王子任，张士璀编著。发育生物学。第二版。北京：高等教育出版社，2006

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