生物有机化学氨基酸的分析方法综述

生物有机化学氨基酸的分

析方法综述

A Review on Amino acid Analysis Methods

摘 要:氨基酸电分析研究是生命科学中令人关注的课题。本文就各种氨基酸的分析化学研究的最新进展进行了综述。 关键词:氨基酸 分析方法 综述

Abstract：The analysis methods of amino acids are very important in ream of industry, agriculture and life science. In this paper，the analysis methods of amino acid are reviewed，with focus on chemistry method, spectrophotometry method, chromatography method and electrochemistry method. Key words: amino acids;analysis;review

1 前言

氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子,氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能,如生

物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系,L 一半胱氨酸能增强生物体的抗病能力,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。目前,对氨基酸的分析测定多采用

[1][3]离了交换色谱( IEC) 、高效液相色谱(HPLC) [2] 或气相色谱(GC)

等仪器,这些仪器所用的检测器包括紫外可见光谱吸收、荧光、化学发光等。然而,由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱, 自身又无荧光,因此不能直接检测。通常需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性。电化学方法以其简单、灵敏、无放射、无污染等特点越来越受到人们的关注。本文对近年来各种化学方法分析氨基酸已获得的进展进行评述。

2 氨基酸的直接电化学分析

对于胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等电活性的氨基酸一般采用直接电分析法[4]。使用循环伏安法[5]可以直接测定L - 半胱氨酸,在pH 值小于7 的磷酸盐缓冲溶液中,在金电极上于0. 96V 处有一氧化峰,在- 0. 75V 左右有一还原峰,氧化峰和还原峰的峰电流的大小与半胱氨酸的浓度成正比。有研究报道,不经衍生化处理,可以直接检测色氨酸和酪氨酸的含量,分别置聚酰胺修饰的碳糊电极于以0. 2mol/LHCl - CH3COONa (pH = 3. 0) 为底液的色氨酸和酪氨酸溶液中,从0. 5V - 1. 50V 进行循环伏安扫描,色氨酸和酪氨酸分别在0. 94V 和0. 92V呈现一个稳定的氧化峰,随扫描次数的增多,两个氧化峰的峰电流都减小,结合2. 5 次微分技术,色氨酸和酪氨酸的检测限可达到0. 024mol/L 和0. 034mol/L ,相对标准偏差分别为5. 2 %和7. %。

3 氨基酸的间接电化学分析

3. 1 通过衍生化反应间接测定多数氨基酸于金

属电极上是非电活性的,无法直接测定,一般是采用衍生化反应[6]

将其转化成电活性的物质进行间接测定。例如,赖氨酸是非电活性的,但将其与芳醛进行衍生化反应后,在约0. 3mol/L 的磷酸盐缓冲溶液中(pH = 11) 衍生产物于峰电位- 1. 12V 处在滴汞电极上生产生一灵敏吸咐还原波,导数波高与赖氨酸浓度有良好的线性关系,检测限为3 ×10 - 8mol/L。莫健伟等人研究了精氨酸、赖氨酸、组氨酸等多种碱性氨基酸与水杨醛在Britton Robinson(B - R) 缓冲溶液中的衍生化反应,衍生产物在- 1. 1V～ - 1. 6V(Vs. SCE) 电位范围有灵敏的极谱行为,并且发现这种行为与氨基酸的结构有关。氨基酸与水杨醛的反应是亲核加成反应,反应的氨基氮原子的电子云密度愈高或醛基碳原子的电子云密度越低,越有利于活性席夫碱的形成,而有利于低浓度氨基酸的测定。

3. 2 通过氨基酸与金属离子配位间接测定氨基

酸作为配体,可与多种金属离子配位,形成电活性的配合物,以提高氨基酸自身的检测灵敏度。如酪氨酸在pH为3. 94 的B - R 缓冲溶液中,在玻碳电极上于1.20V 处出现一氧化峰,们灵敏度较低,加入少量Cu2 +后,此峰消失,在0. 95V 处有一新的氧化峰出现,且灵敏度提高了2 倍多,用新极谱法测得酪氨酸浓度在0. 3～3mg/L 范围内与氧化峰的2. 5 次微分值呈线性关系,检测下限为0. 2mg/L。Gilbert 等人使用CO2 + : - 催化半胱氨酸产生氢波来测定胱氨酸和半胱氨酸的灵

敏度很高。胱氨酸在碱性溶液中被还原成半胱氨酸,半胱氨酸在Co2 + 一氨体系中与Co2 + 络合,于滴汞电极上- 1.55V 处产生—催化氢波,波峰高度与脉冲幅度有关,当用10mV 和30mV 的脉冲时,其检测限分别为5 ×10 - 8mol/L 和5 ×10 - 9mol/L。彭爱红等人用极谱法研究了酪氨酸(Tyr) 、脯氨酸(Pro) 、组氨酸, (His) 与Ni2 + 在硼砂 缓冲溶液中(pH = 9. 2) 配位后的情况,在- 0. 6～ - 1.60V 电位范围内扫描,峰电位分别为- 1. 04V、- 1. 20V、- 1. 34 ,三种氨基酸的峰电流与浓度分别在2. 0 ×10 - 5～3. 0 ×10 - 4mol/L、3. 2 ×10 - 6～2. 2 ×10 - 4mol/L、4. 0 ×10 - 5～2. 5 ×10 - 4mol/L 的范围内呈线性关系。

3. 3 通过电致化学发光分析电致化学发光( ECL)

以其独特的优点在分析当中的应用越来越广泛。ECL[7]是具有电致化学发光活性的物质处于一定的电位时,与溶液中存在的氧化还原性物质作用生成的不稳定激发态回至基态时所产生的化学发光。目前,采用ECL或免疫电化学发光( IECL) 手段对各种氨基酸及蛋白质分析的报道较多。联吡啶钅了[ Ru (bpy) 32 + ]化合物是一种典型的ECL 活性物质,它与氨基酸发生ECl 反应,发出一定强度的光测定氨基酸。

4 色谱法

4. 1 衍生化离子交换色谱法

氨基酸自动分析仪的分析原理是基于阳离子交换树脂分离—柱后茚三酮衍生化分光光度检测方法。该方法以阳离子交换树脂为固定相、酸性缓冲液为流动相,在柱后流出液中加入茚三酮使氨基酸生成

具有可见光吸收的衍生物进行检测,具有重现性好、仪器稳定、结果可靠等优点,适合于大量常规样品的分析。另外,由于衍生化反应发生在氨基酸与其他物质分离之后,因而避免了其他物质的干扰,适合未知复杂样品中氨基酸的分析。其缺点是仪器复杂,体积大,费用高。 此外,由于脯氨酸的测定波长为440 nm ,而其他氨基酸的测定波长为570 nm ,因此脯氨酸不能和其他氨基酸同时测定。

4. 2 衍生化高效液相色谱法

柱前衍生化高效液相色谱法分析氨基酸具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点, 已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的应用。柱前衍生化高效液相色谱法一般采用C18键合硅胶为固定相、极性溶剂/ 弱酸盐缓冲液为流动相。常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA) 、萘- 2 ,3 - 二甲醛(NDA) 、9 -芴甲基氯甲酸酯(FMOC) 异硫氰酸苯酯(PITC) 、丹酰氯(Dansyl - Cl) ] 、4 ,4 - 二甲胺基偶氮苯- 4′- 磺酰氯(DABS - Cl) 、6 - 氨基奎啉- N - 羟基琥珀酰亚胺碳酸盐(AQC) ]和2 ,4 - 二硝基氟苯(DNFB) [8] ]等。OPA 衍生化方法具有样品制备简单、衍生化反应迅速、容易实现自动化操作和灵敏度高的优点,而且试剂本身不发荧光,不会干扰氨基酸的测定;缺点是OPA 不能和仲氨酸反应,与胱氨酸的衍生物产生的荧光强度较低且不稳定。FMOC 衍生化方法灵敏度高,反应快速,FMOC 能仲氨酸反应;缺点是衍生副产物干扰测定,需用戊烷将反应过程中剩余的衍生试剂萃取出以中止衍生反应并避免衍生物的水解。PITC 衍生试剂可同时测定伯氨酸和仲氨酸,衍生副产物对测定无干扰,衍生

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