LC-MS方法(2)

它是借助于电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程，因此也称为放电电离或等离子电离。从液相色谱流出的流动相进入一具有雾化气套管的毛细管，被氮气流雾化，通过加热管时被汽化。在加热管端进行电晕尖端放电，溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态分子碰撞，经过复杂的反应后生成准分子离子。然后经筛选狭缝进入质谱计。整个电离过程是在大气压条件下完成的。

APCI 的优点是：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI 过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3 个数量级；液相色谱-大气压化学电离串联质谱成为精确、细致分析混合物结构信息的有效技术。

伴随着液-质联用接口技术的发展，质谱仪器本身也在不断发展，出现了多种类型的质谱检测器。目前比较常用的质谱仪器有：四极杆质谱仪、四极杆离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪和离子回旋共振质谱仪等。

1 四极杆质谱分析仪

目前，四极杆质量滤器的应用仍然最为广泛。三级四极杆质谱仪的选择反应监测（selected-reaction monitoring, SRM）模式适于进行常规的和高通量的生物分析。四极杆工艺的改进和强稳定性的射频（RF）大大提高了质谱的分辨率，分辨质量数的宽度达到0.1Da，提高了分析化合物的选择性。随着对三级四极杆质谱中碰撞池的改进，出现了高压线形加速碰撞池，提高了对传送离子的能力，降低了物质间的干扰，大大提高了对多组分生物化合物的分析能力。在所有的质谱分析仪中，四极杆质谱仪的定量分析结果的准确度和精密度最好。

2 四极杆离子阱质谱分析仪

在阐明化合物的结构方面，三维的四极杆离子阱得到广泛的应用。与此相关的革新主要有基质辅助激光解吸离子化源、大气压基质辅助激光解吸离子化源、红外多光子光离解技术的发展，以及使用离子阱分析碱性加合离子与金属配位产物的研究。近些年，线形二维离子阱的生产，取得了突破性的进展。这种线形二维离子阱与三维离子阱一样可以对化合物做多级质谱分析，此外还可以积累更多的离子，提高了检测的灵敏度。在与线形加速碰撞池离子化源连接后，可大大提高灵敏度，避免小分子量碎片的干扰，得到更整洁、美观的色谱峰。

3 飞行时间质谱分析仪

随着基质辅助激光解吸离子化技术的出现和计算机的发展，飞行时间质谱仪在20 世纪90 年代得到快速发展。目前，最好的飞行时间质谱分析仪分辨率能够达到20,000Da，测得分子的质量数准确度非常高。飞行时间质谱仪在很大程度上取代了高分辨双聚焦磁扇分析仪，但其不能有效地利用选择离子监测模式进行分析。在高分辨质谱的选择离子监测模式分析中仍然主要使用双聚焦质谱仪。为了使用分辨率高的质谱分析化合物的二级质谱图，人们尝试将飞行时间质谱与其它质谱串联使用，目前使用比较多的是四极杆-飞行时间串联质谱仪，可以帮助我们更准确地了解化合物裂解后离子碎片的质量数。

4 傅立叶变换离子回旋共振分析仪

许多年以来，傅立叶变换离子回旋共振质谱（Fourier-transform ion-cyclotron resonance mass spectrometry, FT-ICR-MS）在气相离子-分子反应的基础研究中成为有效的手段。该质谱与ESI 离子源联接后被广泛地应用于生物大分子的研究，能够充分发挥其高分辨率和准确度的优势。基于傅立叶变换离子回旋共振池内离子的四极激发，该质谱可以选择地累积非共价键复杂化合物的离子，使其能够分析分子量非常大的生物大分子化合物，如分析分子量高达108Da 的大肠杆菌噬菌体的T4 DNA，成为该质谱仪发展的重要里程碑。该质谱仪通过射频脉冲消除其它离子的干扰选择性地捕获目标离子到离子回旋共振池内，也能够进行多级质谱分析。当前又有许多新的离子裂解方法应用到傅立叶变换离子回旋共振质谱仪，如碰撞诱导裂解、激光致光裂解或红外多光子光裂解、表面诱导裂解、黑体红外辐射裂解、电子捕获裂解等，又进一步改善了这种质谱仪分析的性能。

除上面描述的常见的几种接口技术和质谱仪之外，还有其它的一些产品不断问世。近十年来，人们在液-质联用技术的研究方面已经将研究的重点转移到研制适合某种分析领域的强优势的技术，并加速产品的商业化。总之，液-质联用分析技术的发展取决于液-质联用接口技术和质谱分析仪技术的共同发展。通过合适的接口将液相色谱与质谱仪联接，会获得具有特殊分析性能的液-质联用仪器，另外通过接口将质谱与质谱进行串联，可以弥补各种质谱仪的不足，达到取长补短，协同提高的效果。

基体效应

1 基体效应的来源

质效应现象最初在1993年被发现，当改变样品基质的种类和浓度时，待测物电喷雾化质谱的响应值降低了。美国FDA2001年出版的《生物分析方法验证准则》明确提出：在LC-MS分析方法开发和验证过程中需要对基质效应进行评价。基质效应是指样品中除了待测物以外的其他基质成分对待测物测定值的影响，它源自色谱分离过程中与被测物共流出的物质对被测物离子化过程的影响，共流出干扰物可分为内源性杂质和外源性杂质。内源性杂质是指样品提取过程中同时被提取出来的有机或无机分子，当这些物质在共提取液中浓度较高，并与目标化合物共流出色谱柱进入离子源时，将严重影响目标化合物的离子化过程。外源性杂质通常易被人们忽视，但也会带来严重的基体效应。这些干扰物由样品前处理各步骤引入，文献报道的主要包括的聚合物残留、酞酸盐、去污剂降解产物、离子对试剂、有机酸等离子交换促进剂、缓冲盐或SPE小柱材料及色谱柱固定相释放的物质等。

2 基体效应的补偿

基体效应的存在会严重影响对待测物的定量准确度和精密度，且影响因素多变，很难被完全消除。近儿年来，致力于消除和补偿基质效应的研究逐渐增多，主要包括优化质谱条件，优化色谱分离体系，多步净化措施，使用内标物定量，采用基质匹配标准曲线定量，回声峰技术等。

随着联用技术的日趋完善，HPLC-MS逐渐成为最热门的分析手段之一。特别是在分子水平上可以进行蛋白质、多肽、核酸的分子量确认，氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等，这在HPLC-MS联用之前都是难以实现的。HPLC-MS作为已经比较成熟的技术，目前己在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。

1 生化方面的分析中的应用

生物体内的蛋白质、肽和核酸，都以混合物状态出现，具有强极性，难挥发性，又具有明显的热不稳定性，所以用GC-MS来分析生物大分子存在困难，需要经过深度降解，并需对降解生物作各种复杂的衍生化处理。而HPLC能分析强极性、不易挥发、高分子量及对热不稳定的化合物；MS具有高灵敏度，能在复

杂基质中进行准确的化合物的优点，所以HPLC-MS作为生化分析的一个有力工具，正在得到日益的重视。研究人员利用HPLC-MS技术在生化方面己经有很多应用。

2 天然产物分析中的应用

利用HPLC-MS分析混合样品，和其他方法相比具有高效快速，灵敏度高，只需品进行简单预处理或衍生化，尤其适用于含量少、不易分离得到或在分离过程中易的组分。因此HPLC-MS技术为天然产物研究提供了一个高效、切实可行的分析途国内利用该技术在天然产物研究中已经有很多报道。如李丽等利用高效液相色质谱联用技术研究了朝鲜淫羊蕾中的黄酮类化合物。

3 药物和保健食品分析中的应用

质谱作为液相色谱的检测器与紫外和二极管阵列检测器相比较，兼有鉴定功能和灵敏度高的特点。所以近些年来HPLC-MS己经成为药物分析方面的有利工具。近几年用HPLC-MS对各种药物尤其是违禁药物及其代谢产物的研究国内外有大量的文献报道，如尿中的河豚毒素、抗生素、舒喘宁和血液中的安非他明、奥美拉哇、罗呱卡因、氨磺必利、前列腺素EZ以及爱滋病病毒等痕量残留的分析。可以预测，随着对HPLC-MS研究的深入和该技术应用的普及，HPLC-MS技术将成为药物和保健食品中违禁成分分析中发挥更大的作用。

4 环境分析中的应用

HPLC-MS己经在环境分析中有很多的应用，如环境样品中的抗生素、多环芳烃、多氯联苯、酚类化合物、农药残留等。尤其是近些年，农药残留问题一直是个热门话题。由于农药正向高效和低毒方向发展，使农药的环境影响和残留农药的检测方法发生了变化。由于目前低浓度、难挥发、热不稳定和强极性农药分析方法并不是十分理想，因此发展高灵敏度的多残留可靠分析方法己成为环境分析化学及农业化学家的重要战略目标。高效液相色谱法弥补了气相色谱法不宜分析难挥发，热稳定性差的物质的缺陷，可以直接测定那些难以用GC分析的农药。但是常规检测器如紫外(UV)及二极管阵列(PAD)等定性能力有限，因而在复杂环境样品痕量分析时的化学干扰也常影响痕量测定时的准确性，从而限定了他们在多残留超痕量分析中的应用。自从80年代末大气压电离质谱(APIMS)成功地与HPLC联用以来，HPLC-MS已经在农药残留分析中占了很重要的地位，成为农药残留分

析最有力的工具。

液质联用仪使用经验（教训）交流总结

一、做液质，加离子诱导剂得是挥发性的，生物碱用甲酸或乙酸 二、我认为要维护好仪器 首先流速不能过大，液质是不能承载过大流速的； 其次电压不要加到极限，尤其是正负离子转换时要适当调整； 最后是做完样一定要及时冲洗和吹扫管路。

三、LC和MS的条件优化是成功的关键。

四、1、由于液质的流速较小（ESI一般为0.2ml/min），所以配置样品的溶剂强度不能太大，尽量小于起始比例，否则，会出现保留时间偏移等问题。 2、如果在液相上摸好的条件，注意尤其是流动相的组成要转化成合适LCMS分析的。 3、磷酸盐及其他不挥发缓冲盐在离子源会沉淀并堵塞毛细管等，要更换成可挥发的有机缓冲盐。 4、缓冲盐会导致离子抑制，因此要控制缓冲液的强度，<10mM。 5、去污剂、表面活性剂会有离子抑制现象发生， 表面活性剂产生的加合物和离子簇会干扰质谱数据，因此作液质联用仪时，不要使用洗涤剂清洗玻璃器皿等容器，如果一定要用，建议超声清洗多次。

五、 要做好质谱的维护工作，就得从小处着手。比如分析的样品必须要干净，这样既可以保护色谱柱，也可以防止污染质谱；分析了大量的生物样品后，冲洗系统时，先用高比例的水相冲洗，把源也给洗一下，然后再换用高比例的有机相，这时要把柱后管路从源上拿下来，避免柱中的杂质给冲进质谱??细节很多很多，大家在日常应用中尽量注意和避免就可以了。

六、1.前处理：样品一定要干净，不管是为了质谱还是为了保护柱子，生物样品提取的好些，如果直接沉淀，一定要注意，尽量高转速12000rpm以上，低温离心，最好离2次（保险一点），转移样品也要仔细，从中间慢慢吸，有时会有漂浮物，岛津的质谱好像做直接沉淀的源比较容易堵，Waters的好些。

2.样品浓度：质谱是灵敏度很高的仪器，进样浓度一定不能太高，1－2ug/ml已经可以啦，太高的浓度对仪器来说比较容易造成残留，而且定量也会不准啦。

3.流动相：流动相中尽量加易挥发的盐，尽量不要加表面活性剂之类的，容易离子抑制，如果遇到离子抑制，可以试试把你的样品峰往后推推或者改变提取方法，也可以试试用APCI源。如果你的液相是低压混合的，尽量不要跑梯度，

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