DSS诱导的结肠炎是由NLRP3炎症小体介导的

DSS诱导的结肠炎是由NLRP3炎症小体介导的 摘要：

背景：前炎性细胞因子IL-1β、IL-18在炎症性肠病的发病中起着重要作用，在应对多种微生物和晶质的反应中，两种细胞因子都通过caspase-1激活的多种蛋白复合体的处理，这种多蛋白复合体就是炎症小体（NLRP3），在此我们将会研究NLRP3在DSS诱导的结肠炎小鼠中的作用。

方法：应对DSS诱导产生的IL-1β，我们对野生型、Caspase-1-/-、NLRP3-/-、ASC-/-、Cathepsin（组蛋白酶） B-/-、Cathepsin L-/-小鼠的巨噬细胞进行研究。C57BL/6和NLRP3-/-小鼠通过口服DSS进行诱导，每天进行临床疾病活动指数评分，确定结肠的组织损伤的严重程度和细胞因子的表达。

结果：在体外用DSS刺激巨噬细胞以Caspase-1依赖的途径分泌较高水平的IL-1β。IL-1β的分泌可被敲除NLRP3、ASC或Caspase-1所阻断，表明DSS激活Caspase-1是通过NLRP3炎症小体。另外，IL-1β的分泌还依赖于吞噬作用、溶酶体成熟、组蛋白酶B和L以及活性氧，在灌胃DSS之后，NLRP3-/-小鼠相比于野生型小鼠产生较弱的结肠炎症并在结肠组织中产生的前炎性因子的水平比较低。用药物Pralnacasan抑制Caspase-1相比于NLRP3缺陷具有相似的黏膜保护作用。 结论：NLRP3在DSS诱导的小鼠肠道炎症中发挥着重要作用。NLRP3炎症小体可作为IBD病人新的治疗作用的潜在靶点。 这项研究的意义：

关于这个领域有哪些是已知的？

1、 前炎性细胞因子IL-1β和IL-18在IBD发病中所起到的重要作用。 2、 IL-1细胞因子家族的激活和分泌是由NLRP3炎症小体来调节。

3、 单核苷酸多态性： NLRP3基因区和其他的炎性相关基因的单核苷酸多态性与克罗恩

疾病的易感性相关。 最新的发现有哪些：

1、 运用DSS诱导的急性结肠炎模型，我们发型NLRP3炎症小体缺乏的小鼠具有对结肠炎

明显的保护作用。

2、 我们发现DSS对巨噬细胞的NLRP3炎症小体在体内外都具有激活作用。

3、 IL-1β的分泌依赖于对DSS大分子的吞噬作用、溶酶体的成熟、组蛋白酶B和L以及活

性氧

对可预见的未来临床应用的影响：

NLRP3炎症小体可作为治疗IBD的潜在的新的靶点。 简介：人类炎症性肠病（IBD），主要是溃疡性结肠炎和克罗恩病，是由慢性胃肠道黏膜免疫系统失调所引起的慢性的、周期性复发和恢复的炎症状态。IBD的确切的发病机制仍未完全的了解。但是，被广泛接受的是基因和环境因素都参与其中。结肠炎实验动物模型被建立应用于研究IBD发病的分子和细胞机制，并且这些模型被广泛应用于新型抗炎药物的开发和活性评价。在DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型中，饲喂小鼠含有DSS多聚物的饮用水，可诱导腹泻、血便、体重下降、炎症和溃疡的组织学切片（人类IBD也会发生的状态）为特征的肠炎。因为急性肠炎反应不依赖于T、B细胞这个模型主要应用于固有免疫对肠道炎症的作用，这可能与DSS对粘膜的毒性作用和上皮屏障功能失调相关。

前炎性细胞因子包括IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α在活动性IBD中都能检测到并且与炎症的严重程度相关。IL-1β和TNF-α可改变上皮细胞的紧密连接和肠道的通透性。因为上皮屏障的完整性对于阻断微生物的侵入以及对其下组织的毒性、IL-1β在级联式引起炎症结肠的早期阶段具有重要作用。实际上，IL-1β在DSS诱导的小鼠结肠黏膜和腹腔巨噬细胞都有水平的升高，可以进一步代表肠道炎症的起始。IL-1β和IL-18由Caspase-1激活，并且在Caspase-1-/-小鼠强烈表明Caspase-1在DSS诱导的结肠炎中起到十分重要的作用。 NLR（核苷酸结合区域和亮氨酸富集区域）家族，包括大量的细胞内模式识别受体。NLRs含有亮氨酸聚集区可识别多种病原体相关分子模式。NOD2和NLRP3是两种具有特点的NLR，并且这些受体的基因突变与克罗恩疾病相关。NOD2识别细菌肽聚糖衍生分子胞壁

酰二肽（MDP）并激活NF-κB信号通路产生炎症反应。NOD2基因突变在克罗恩疾病个体中被发现。这种多态性与NF-κB的激活和IL-1β的分泌相关。但是，具体地NOD2、NF-κB和前炎性细胞因子Pro-IL-1β/IL-1β之间的关系仍存在争议。NLRP3,作为一种cryopyrin｛cryopyrin 是核苷酸结合区域（nucleotide-binding domain, leucine-rich-repeat-containing family）｝组成了炎症小体通过衔接蛋白ASC和Caspase-1将Pro-IL-1β和Pro-IL-18转变为它们的活性形式。NLRP3的突变可能导致慢性自身免疫综合征。NLRP3基因的单核苷酸多态性与克罗恩疾病的易感性密切相关。另外，联合NLRP3和CARD8的多态性在瑞典男性群体中与克罗恩疾病有密切关系。

最近研究发现自噬蛋白 autophagy Protein Atg16LI是克罗恩疾病的进一步地易感因子。明显地，Atg16LI缺陷引起Toll/IL-1受体包含区域适配器诱导Interferonβ（TRZF）依赖的Caspase-1的激活，造血细胞中Atg16LI缺陷小鼠DSS诱导的急性结肠炎的易感性增加，这些小鼠的IL-1β和IL-18的水平的增加和粘膜炎症的严重程度相关，表明解除对Caspase-1活性的管制在IBD和DSS诱导的溃疡性结肠炎发病中具有重要作用。这项研究中，我们探究在NLRP3炎症小体基因敲除鼠科巨噬细胞中Caspase-1活性对DSS的反应。另外，NLRP3炎症小体在肠道炎症中的作用通过DSS诱导的急性肠炎模型来研究。

方法：细胞培养和试剂：WT、Caspase-1-/-、NLRP3-/-、ASC-/-、Cathepsin B-/-、Cathepsin L-/-和IPAF-/-小鼠巨噬细胞系有所述方法得到。细胞用DMEM培养基，高葡萄糖，给予1%L型谷氨酸盐，10%胎牛血清和10ug/ml的环丙沙星。人类单核细胞系（THP-1）培养在RPMI培养基中加入10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，10ug/ml环丙酰胺。在DSS刺激前先用佛波酯（PMA）分化3h。初始人类巨噬细胞来源于正常人的附着的外周血单个核细胞（PBMCs），用RPMI+2?血清、1%L型谷氨酸盐，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素的培养基培养，同时加入100U/ml重组人类粒细胞刺激因子（rhGM-CSF）；Caspase-1的抑制剂Z-YVAD-fmk、尼日利亚菌素(nigerincin) 、细胞松弛素D（Cytochalasin D）、博来霉素（bafilomycin A）购买于（**），多聚（dA，dT）钠盐、N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine NAC），ADPC和葡聚糖酶（dextranase）购买于Sigma-Aldrich；所有的DSS试剂购买于MP Biomedicals；超纯脂多糖LPS K2和四甲丫啶（acridine orange）购买于Invitrogen。Caspase-1抑制剂Pralnacasan 由Sanofi-Aventis提供，聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）购买于BASF。 斑点形成实验（Speck formation assay）

运用稳定表达ASC-CFP荧光蛋白的融合蛋白的巨噬细胞来研究含有ASC的NLRP3炎症小体的聚集。细胞以1*106个/孔铺板子，用10ng/ml LPS 启动2h后用DSS共孵育24h。洗完细胞后，ASC-CFP斑点的形成通过荧光显微镜分析，每个区域的斑点数目用Image J软件来分析。

流式细胞术（Flow Cytometry）

巨噬细胞在24孔板中用DSS刺激培养24h用于溶酶体（lysosomal）的研究。细胞洗过之后用1ug/ml吖啶孵育15min用于溶酶体染色，细胞系两遍后，用FACSCantoⅡ 在600-650nm发射光波长处用于荧光强度分析。所得数据用FlowJo软件分析。 小鼠（Mice）

NLRP3-/-小鼠饲养于 University of Munich ,8-16周龄小鼠用于实验。年龄相匹配的野生型的对照小鼠购买于 Harlan Winkelmann，老鼠饲喂标准鼠粮，给予瓶装自来水，在开始分入试验组前先适应7天，所有的实验都经动物研究伦理会的批准，与合理运用动物与生物医学研究的指导原则相一致。

结肠炎的诱导和治疗（Induction of colitis and treatment）

结肠炎的诱导是通过将DSS（分子量40KD 浓度2%）溶于饮用水中让C57BL/6和NLRP3-/-小鼠自由饮水1-9天获得，对照组小鼠给予自来水。Caspase-1的抑制剂Pralnacasan溶于聚氧乙烯蓖麻油，浓度为25%，用0.2um的过滤器滤过，药物腹腔注射，50mg/Kg每天两次，对照组小鼠腹腔注射蓖麻油每天两次。

临床评分和组织学评分（Clinical Score and histological analysis）

体重、粪便隐血、经直肠出血和粪便硬度有两个研究者双盲评价。一个评分体系用于评价腹

泻、隐血、明显出血。体重变化以基线水平下降的百分比来表示。尸检取出结肠，结肠片段用于ex-vivo分析。组织学：环切结肠组织横断面，4%的福尔马林溶液固定，石蜡包埋，根据标准操作规程部分结肠用于H&E染色，病理学家通过blinding way 的方式进行形态学评分。在肠道固有层有炎性细胞数量的增多记1分，炎性细胞汇集于粘膜下层记2分，透壁性浸润记3分。对于组织损伤：离散的粘膜上皮损伤记1分，粘膜侵蚀记2分，深度的粘膜损伤或深度的肠壁结构的受损记3分。这两种等权重的评分方式（细胞浸润和组织损伤）加在一起，结肠组织学病理严重程度的评分从0分到6分。

体外分析结肠组织中的细胞因子（Ex vivo analysis of colonic cytokines）

结肠用机械方法进行压碎，200μl组织蛋白提取试剂中涡旋1分钟，用液氮冷冻。4℃条件下10000g离心15min匀浆液。提取总蛋白用BioRad 蛋白试剂进行定量。结肠匀浆中的IFN-γ，IL-1β和TNFα用ELISA的方法进行定量。 mRNA的提取和逆转录PCR（mRNA extraction and reverse transcription-PCR，RT-PCR） 结肠组织用PBS冲洗干净，用液氮迅速冷冻，并存储在-70℃条件下。匀浆组织中总的RNA用VltraTurrax 仪器和Roche总RNA组织提出试剂盒提取获得。RNA的总量和纯度用分光光度法来检测，并稀释成统一浓度。逆转录反应体系：M-MLV逆转录酶（**公司），RNA水解酶抑制剂（**公司），低聚脱氧胸苷（dT）用于cDNA合成（**公司）。光循环仪和DNA掺杂荧光染料（Fast start DNA Master SYBR Green I kit）用于实时PCR，依据试剂厂商的操作说明进行。鼠科磷酸甘油醛脱氧酶基因引物（GAPDH，glyceraldehyde phosphate delydrogenase）和IP-10（CXCL-10）的引物作为光循环系列中的标准DNA，每个样本的拷贝数都与GAPDH的拷贝数相关。

分离腹腔巨噬细胞（Isolation of peritoneal macrophages）

在异丙烷全身麻醉的条件下颈椎脱臼（cervical dislocation）处死小鼠，腹腔内注射10mlPBS溶液，摇晃后，进行腹腔灌洗（peritoneal lavage），收集腹腔灌洗液，红细胞用红裂液裂解。剩余的细胞种在细胞培养板上过夜，粘附的细胞用于细胞因子的检测。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot（SDS-PAGE and western blotting） 106个细胞培养上清或65μg结肠匀浆的总蛋白溶于Laemmli 缓冲液（BioRad），并用15%的 acrylamide-bisacrylamide 凝胶进行分离。蛋白印在0.4μm的聚乙二烯氟化物（PVDF）膜上，起始的抗Caspase-1和抗IL-1β的抗体浓度为1：500稀释，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）相连的β-actin（上样标准，loading control）浓度为1：3000，发光液ECLTM通过化学发光提供可视化。 数据分析（Statistical analysis）

数据以mean±SEM的形式呈现出来，实验与对照组的统计学意义以t检验的方式检测，P<0.05视为具有统计学差异。 结果

鼠科巨噬细胞中DSS促进Caspase-1依赖的IL-1β的处理

DSS induces caspase-1-dependent IL-1β processing in murine macrophages 激活的IL-1β的释放有两步完成，首先由Pro-IL-1β的转录起始，例如Toll样受体受到刺激，接着是caspase-1介导的剪切。DSS（硫酸化的高分子量的右旋糖苷的多聚阴离子衍生物），诱导IL-1β从鼠的巨噬细胞中释放。为了研究IL-1β的分化机制我们用鼠巨噬细胞系和DSS共孵育24h，（先前给或不给LPS启动）。在缺少LPS启动下，DSS未能诱导产生明显的IL-1β的释放。但是，LPS启动的巨噬细胞对加入的DSS以剂量依赖的方式产生强烈的应答。（Fig1A）。IL-1β的生成需要LPS的启动进一步由联合MyD88、TRIF同时缺陷的巨噬细胞系中的数据得到支持，此细胞系用DSS和尼日利亚菌素（nigericin，一种钾离子载体可激活Caspase-1，但是对多聚dA-dT有反应，以TLR依赖的方式诱导IL-1β的产生）刺激都不再产生IL-1β（Fig1B）。为了阐明Caspase-1在DSS介导的IL-1β释放中的作用，我们给予细胞Caspase-1抑制剂Z-YVAD-fmk并且发现它完全废止了IL-1β的释放。相同的结果在运用野生型小鼠的初始腹腔巨噬细胞（Fig1D）和初始人类巨噬细胞和THP-1细胞系中得到了支持（Supplementary figure 1）。为了证实IL-1β是以它的活性形式释放出来，我们对IL-1β P17和Caspase-1 P10进行Western blot，同时对DSS和尼日利亚菌素刺

激的巨噬细胞的上清进行了相同的处理（Fig 2E）。为了确定是否摄入DSS大分子为Caspase-1的激活所必需，我们在对巨噬细胞刺激前用葡聚糖酶降解DSS（葡聚糖水解酶可以切断异麦芽糖的1-6糖苷键）葡聚糖酶几乎全部抑制了IL-1β的释放（Fig1.F）。用8-1400KDa分子量的DSS与巨噬细胞共孵育，得出IL-1β的分泌和DSS的分子量呈正相关性（Fig 1G），提示，IL-1β的分泌只是大分子量的DSS摄入所诱导的。 DSS induces NLRP3 inflammasomeactication DSS诱导NLRP3炎症小体的激活

NLR（核苷酸结合区域、亮氨酸富集区域）NLRP3能够形成一个炎症小体，并有衔接分子(adaptor molecule) ASC和Caspase-1应对各种刺激。我们推测DSS激活的Caspase-1是由NLRP3炎症小体介导。NLRP3炎症小体的激活依赖于钾离子流，为了评价NLRP3在DSS诱导的Caspase-1激活中的作用，我们在细胞外培养液中加入高浓度的KCl发现可以完全抑制IL-1β 的释放（Fig 2A）。另外,缺失NLRP3、ASC或Caspase-1的巨噬细胞对DSS的刺激缺乏IL-1β的分泌（Fig 2B）。与先前的观察结果相一致，对转染的多聚dA：dT，呈现NLRP3的非依赖性和ASC的依赖性。相对比地：IPAF-/-的小鼠（IPAF是NLRP3非依赖的，Caspase-1募集炎症小体）在IL-1β的分泌中无缺陷。（Fig 2C） IL-1β的分泌需要NLRP3这一论点进一步由研究NLRP3-/-小鼠的腹腔巨噬细胞所支持（Fig 2D）。NLRP3的激活引发了ASC的大量聚集，ASC进一步激活了Caspase-1。为了分析ASC的招募情况，我们运用了稳定表达ASC-荧光蛋白 融合蛋白稳定表达的巨噬细胞。NLRP3-ASC的聚集导致了荧光流（fluorescent speck）的形成，这可以在荧光显微镜下观察到。DSS以浓度依赖的方式诱导荧光流的形成。（Fig 2E）。我们可以通过缺乏P2X7的巨噬细胞应对DSS刺激IL-1β的分泌未受影响而排除（rule out）DSS直接或间接通过P2X7受体诱导NLRP3炎症小体的激活（fig 2F）。总之，这些发现表明DSS激活了NLRP3-ASC复合体，导致了Caspase-1的激活使Pro-IL-1β切割成成熟的分泌形态。

NLRP3 inflammasome activation in response to DSS is dependent on lysosomal maturation and reactive oxygen species （ROS）

DSS刺激的NLRP3炎症小体的激活依赖于溶酶体成熟和活性氧生成

细胞自噬（phagocytosis）作为一种特殊的病原体相关分子模式通过溶酶体的产生而能够激活炎症小体NLRP3。为了进一步描述NLRP3炎症小体在DSS诱导下激活的机制，我们通过药理学阻断溶酶体形成和发挥功能的通路。为了研究吞噬体的形成在Caspase-1激活中的作用，我们在DSS孵育巨噬细胞之间加入了细胞松弛素（Cytochalasin D，可以通过扰乱肌动蛋白纤丝抑制细胞自噬），细胞松弛素完全废除了DSS介导的IL-1β的分泌，而对钾离子载体尼日利亚菌素产生的作用没有任何影响。（Fig 3A）。另外，通过博来霉素（bafilomycin A1，一种液泡H+ATP酶抑制剂）完全抑制了DSS介导的IL-1β的释放。这些发现表明功能性溶酶体在DSS介导的NLRP3的激活中发挥着确切的作用。运用特异性的Cathepsin的抑制剂的实验表明在应对结晶或者流行病毒时溶酶体半胱氨酸蛋白酶和NLRPs炎症小体的激活之间存在着一定的联系。为了评价这种机制是否适用于DSS诱导的NLRP3炎症小体的激活，我们比较了WT的巨噬细胞以及Cathesin B和 Cathepsin L缺失的巨噬细胞的IL-1β的释放情况。IL-1β 在DSS诱导的巨噬细胞中的分泌由于Cathepsin B的缺失而显著下降，cathepsin L的缺失引起相对低一些的IL-1β分泌的下降。（fig 3B）。因此，溶酶体（半胱氨酸）蛋白酶在DSS诱导的炎症小体的激活中发挥作用。我们进一步评价DSS是否引起了溶酶体的损伤（如被提到的晶体结构）。我们运用吖啶的染色特性（一种染料，单体形态下呈现绿色荧光，酸性条件下二聚体形状呈现红的荧光，红色荧光的密度与细胞之中溶酶体的数量呈正相关）。实际上，DSS诱导产生的吖啶染色的巨噬细胞的红色荧光强度的下降与先前报道的结构学数据相一致，表明存在溶酶体损伤（Fig 3C）。总之，DSS介导的吞噬体的不稳定性，产生了吞噬体中内容物向细胞质中的释放，并由NLRP3在细胞之中所感知。

NLRP3炎症小体的激活与在应对多种刺激时ROS（活性氧）的产生有关。先前表明DSS可以刺激巨噬细胞ROS的产生。为了研究ROS在DSS诱导的IL-1β释放中的作用，我们给予巨噬细胞ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAc）和ADPC，两种抑制剂均能明显降低

IL-1β的分泌（Fig 3D），这些数据表明ROS在DSS诱导的NLRP3炎症小体激活中具有促进作用。

Colitis Severity and Inflammatory response in DSS model depend on NLRP3 signaling

在依赖NLRP3信号通路的DSS模型中的结肠炎的严重程度和炎症反应

我们下一步在体条件下研究NLRP3炎症小体在DSS介导的炎症肠病中的作用，WT和NLRP3-/-下属接受2%DSS饮用水连续9天，每天检测临床指标包括：体重、粪便隐血、经结肠出血。NLRP3-/-的小鼠对DSS诱导的结肠炎有明显的保护作用，体重减轻和便血均有改善（Fig 4）。值得注意的是15只野生小鼠中有4只在第9天由于结肠炎死掉，而15只NLRP3-/-小鼠存活。在第6天获得的结肠组织的组织学分析表明，在NLRP3-/-小鼠中粘膜炎症细胞的浸润和组织损伤程度都有减轻，表明对结肠组织炎症程度评分有明显改善（Fig 4B）。在第9天，组织学表明WT和NLRP3-/-都相同严重程度的肠道炎症和上皮损伤，尽管NLRP3-/-小鼠的结肠炎的临床评分相对较低。这一发现说明NLRP3炎症小体在结肠炎的诱导早期具有至关重要的作用，但是敲除NLRP3也无法阻止长期用DSS诱导的结肠炎的发病进程。因为Caspase-1的活性由NLRP3的调节，抑制Caspsase-1的活性可能成为新的治疗IBD的有效方式，与这一理念相符合（In line with this notion），我们之前报道过用Pralnacasan 抑制Caspase-1在DSS诱导的实验性结肠炎中有治疗作用。给小鼠Pralnacasan 的最佳剂量在我们先前的实验中己经确定，可以改善的临床指标例如：体重、粪便性状、粪便出血。（Fig 4C）事实上，Pralnacasan的治疗效果和NLRP3-/-的效果量级相一致，说明通过NLRP3炎症小体对Caspase-1的激活是DSS诱导的结肠盐的主要发病机制）。

在人和急性DSS诱导的结肠炎小鼠模型的结肠组织中前炎性细胞因子包括IL-1β、TNF-α和INF-γ均提高，为了评价NLRP3炎症小体对肠道炎症反应的影响，我们首先分析了接受DSS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的IL-1β的产生。由于DSS诱导WT中腹腔巨噬细胞IL-1β的释放量升高，相对比地，NLRP3-/-小鼠巨噬细胞在不加DSS诱导IL-1β的水平检测不到，对DSS也只有低水平的响应。（Fig 5A），进一步地，在DSS诱导第六天的小鼠结肠匀浆中TNF-α、IFN-γ、IP-10的水平在WT小鼠中升高，而在NLRP3-/-小鼠中无变化（Fig5B）。有趣得是：在饮用自来水的NLRP3-/-小鼠中这些细胞因子的水平也有所下降，提示，NLRP3可能在肠道稳态生理中发挥重要作用。不过，WT和NLRP3-/-小鼠结肠匀浆中IL-1β的水平无明显差异。因为ELISA无法区分Pro-IL-1β和激活的IL-1β，我们使用western blot分析剪切过的IL-1β（P17），并发现在DSS诱导的WT小鼠结肠中激活的IL-1β升高，而NLRP3-/-小鼠无变化。（Fig 5C）。 Discussion 讨论

人类样本和鼠科动物结肠炎模型表明过多表达IL-1β和IL-18在IBD发病中发挥重要作用。而且，Caspase－１（调节生物学活性形式的IL-1β和IL-18的分泌）被认为是DSS诱导的结肠炎的重要介质。在当前研究中，我们发现DSS诱导Caspase-1的激活是通过巨噬细胞中的NLRP3炎症小体所介导，并且NLRP3-/-小鼠对DSS诱导的结肠炎具有保护作用，结肠的临床和组织学严重程度均有所下降，并且结肠组织中的前炎性细胞因子水平也下降。这些保护作用主要发生在疾病的起始阶段，表明NLRP3炎症小体在炎症过程的起始阶段发挥重要作用。有趣的是NLRP3-/-小鼠和Pralnacasan给药的WT小鼠的临床严重程度评分相近，表明药理学干预NLRP3炎症小体复合物对IBD具有潜在的治疗作用。 NLRP3炎症小体激活的确切机制未被完全理解。在这项研究中得到的数据表明DSS诱导的巨噬细胞IL-1β的释放需要溶酶体的成熟溶酶体蛋白CathepsinB和CathepsinL的存在，溶酶体完整性的破坏以及ROS的产生。这些机制与先前描述的其他NLRP3的刺激（如 尿酸钠、石棉、二氧化硅晶体和流行性病毒）的机制相似。DSS刺激巨噬细胞IL-1β产生实验可以作为针对NLRP3炎症小体治疗IBD疾病的药物的高通量筛选方法。

对于人类更好了解IBD这些发现在那些方面具有贡献？基因学研究表明NLRP3炎症小体组件的基因突变与IBD存在联系。Villani和他的同时发现克罗恩疾病的易感性和存在于1q44染色体上的NLRP3下游的可推测的调节区域的多态性有关。有趣的是：这些多态性与PBMC

在应对LPS刺激过程中IL-1β的损伤过程有关。提示：NLRP3介导的Caspase-1的激活可能在IBD中起到保护作用（例如，抵御病原体微生物的入侵）。另一方面，McGovern和他的同事检测了IBD和CARD8（CXOX）基因多态性的关系，尽管这未被其他人所证实。CARD８是NLRP3的伴侣分子就如同NLRP3炎症小体的一个成分，他被认为可以抑制NF-κB的活性并调节Caspase-1的活化。与NOD2突变相似，CARD8的突变可导致NF-κB通路的紊乱，最终导致肠道固有层巨噬细胞中Pro-IL-1β和Pro-IL-18 的上调。在相同的模型中，NLRP3的功能增强性突变可导致Caspase-1的过度激活，剪切Pro-IL-1β和Pro-IL-18为他们的活性形式。为了支持这项假设，Schoultz和他的同事最近报道在瑞典人群中联合突变NLRP3和CARD8可增加克罗恩疾病的易感性。

这种Caspase-1激活的“two hit”model 导致患IBD人IL-1β和IL-18的分泌在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中得到了相似的反应。最初，DSS表现出对肠道上皮的直接毒性作用，因此允许细菌直接通过TLRs和NF-κB信号通路刺激肠道固有层巨噬细胞，导致Pro-IL-1β和Pro-IL-18的转录。第二步，DSS通过NLRP3炎症小体促进Caspase-1的激活，剪切IL-1β和IL-18 为它们的固有形式，如此启动了肠道炎症的级联反应。我们的数据可以帮助理解DSS诱导的结肠炎这一简便快捷的重要的IBD动物模型的可能的机制。

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