青藤碱对脑缺血再灌注损伤大鼠环氧_省略_酶_2表达和血脑屏障通透(2)

LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.4时珍国医国药2010年第21卷第4期

pressionofcyclooxygenase-2andthepermeabilityofblood-brainbarrier.Ithasprotectiveeffectoncerebralischemiainjury.

; Blood-brainbarrierKeywords:Sinomenine; Ischemia-reperfusion; Cyclooxygenase-2 研究表明,炎症反应是脑缺血再灌注损伤的重要病理生理机

制,花生四烯酸环氧化酶途径在缺血后神经元损伤的炎症机制中具有重要作用。诱导型环氧化酶-2(COX-2)是催化花生四烯酸合成前列腺素E2(ProstaglandinE2,PGE2)的关键酶,而PGE2是炎症反应中最主要的炎症介质之一。青藤碱(sinomenine,Sin)是从中药青风藤Sinomeniumacutum中提取的生物碱单体,具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等药理作用[1,2]。体外实验表明[3],Sin对COX-2活性有选择性抑制作用。本研究旨在观察Sin对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠COX-2活性和血脑屏障通透性的影响,从而探讨Sin脑缺血再灌注损伤的影响及机制。1 仪器与材料

751分光光度计(上海仪表九厂),青藤碱粉(湖南正清医药公司),TTC试剂(上海医药总公司),COX-2一抗(武汉博士德生物工程公司)。健康Wistar大鼠,雄性,清洁级,共80只,质量(250?30)g(广西医科大学动物实验中心提供)。2 方法

2.1 给药方法将实验动物按随机分组原则分成假手术组(20只)、缺血再灌注组(20只)、Sin低剂量治疗组(20只)及Sin高剂量治疗组(20只)。Sin低剂量治疗组(30mg/kg)和高剂量治疗组(60mg/kg)均于术前30min分别给予大鼠腹腔注射,假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水腹腔注射。缺血再灌注组和Sin低、高剂量治疗组建立脑缺血90min再灌注24h动物模型。

2.2 动物模型的建立参照Longa等[4]的方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法,各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。线栓采用石蜡线栓。线栓直径约0.27mm,插入深度约18mm,此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90min时,抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分:按照Longa等[4]的评分标准,各组分别在再灌注24h进行评分。0分:正常,无神经学征象;1分:动物不能完全伸展右前肢;2分:动物右侧肢体瘫痪,行走时向右侧转圈,出现追尾现象;3分:动物行走向右侧跌倒,或动物不能站立或动物打滚;4分:无自发活动,有意识障碍。神经功能缺陷评分在1~3分为模型成功。0分和4分为模型不成功予以剔除,在后续实验中补充剔除出组的动物,以保证每组动物数不变。

2.3 COX-2免疫组化染色再灌注24h,各组随机取5只大鼠,用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定,断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7~11mm之间冠状切取约5mm厚脑组织块,固定、脱水、包埋成蜡块,连续切片,厚5Lm。连取5张,1张作HE染色,其余4张作免疫组化染色。用SP法进行COX-2的免疫组化染色。阴性对照片用PBS液代替一抗。于每个鼠脑取1张切片,每张切片分别随机选取左侧大脑半球额顶部皮质5个不重复高倍镜视野(400@),计数每个视野阳性细胞数,算出平均数即为每张切片阳性细胞数。

2.4 脑含水量检测再灌注24h,各组随机取5只大鼠,断头取脑后快速称取左右大脑半球湿重,置110~115e烤箱内烤至恒重,再分别称其干重,用(湿重-干重)/湿重的百分比作为衡量脑含水量指标。

2.5 血脑屏障通透性检测参照Matsuo等[5]的方法,采用EB染料检测BBB通透性。再灌注24h,各组随机取5只大鼠,经股静脉注射2%EB生理盐水3ml/kg。2h后,大鼠麻醉,由左心室用生理盐水灌流至右心耳流出清亮液体,然后断头取脑,称湿质量后置入装有0.5ml1mol/LKOH溶液的离心管中,37e过夜,然后加入丙酮。离心15min,重复3次取上清液,用751型分光光度计在波长620nm处测定吸光度值。根据EB液的标准曲线,

计算脑组织中的EB水平。2.6 TTC染色再灌注24h,将各组另外5只大鼠深麻后开颅取脑。将鼠脑置于-4e冰箱20min后,将其切成5等份冠状位切片,置于2%TTC溶液中,水浴、多聚甲醛液固定。用计算机病理图像分析仪及梯形法计算出梗塞灶体积,各脑片梗塞灶体积之和即为梗塞体积。

2.7 统计学方法数据处理采用SPSS13.0统计软件进行运算,结果以 x?s表示,组间差异显著性检验采用方差分析。3 结果

3.1 各组神经功能评分的比较见表1。假手术组无神经功能缺损。与假手术组比较,缺血再灌注组神经功能评分明显增加(P<0.05),Sin高、低剂量治疗组大鼠的神经功能评分低于缺血再灌注组(P<0.05),高、低剂量组之间差异有显著性(P<0.05)。

3.2 各组脑梗塞体积的比较见表2。TCC染色后,缺血再灌注24h左侧大脑半球梗塞灶区呈白色,主要为额顶部皮质和尾壳核,正常组织呈红色(图1)。Sin高、低剂量治疗组梗塞体积较缺血再灌注组显著减小(P<0.05)。Sin高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组神经功能评分的比较( x?s)组别假手术缺血再灌注Sin低剂量治疗Sin高剂量治疗

分

神经功能评分

02.60?0.55v1.20?0.45*1.40?0.55*w

与假手术组比较,vP<0.05;与缺血再灌注组比较,*P<0.05;与

w

Sin低剂量治疗组比较,P<0.05;n=5

3.3 脑含水量和EB含量的比较见表2。缺血再灌注组脑含水量和EB含量明显升高,与假手术组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);与缺血再灌注组比较,Sin高、低剂量治疗组脑含水量和EB含量明显降低(P<0.05),高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组脑梗塞体积、脑含水量和EB含量的比较(x ?s)组别脑梗塞体积V/mm3假手术0缺血再灌注188.0?10.71v

*

Sin低剂量治疗136.9?8.37Sin高剂量治疗112.82?9.03*w

脑含水量(%)EB含量C/Lg#g-1

78.71?1.1878.71?1.1896.92?2.27v96.92?2.27v89.24?1.25*89.24?1.25*

*w

83.79?1.9783.79?1.97*w

与假手术组比较,vP<0.05;与缺血再灌注组比较,*P<0.05;与

w

Sin低剂量治疗组比较,P<0.05;n=5

3.4 各组COX-2表达的比较见表3。假手术组脑组织中未见COX-2阳性表达。缺血再灌注组和Sin高、低剂量治疗组COX-2免疫阳性细胞主要存在于额顶部皮质,纹状体区亦有少量表达(图2)。Sin高、低剂量治疗组额顶部皮质COX-2表达较缺血再灌注组减少(均P<0.05);高、低剂量组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组COX-2表达的比较(x ?s)组别假手术缺血再灌注Sin低剂量治疗Sin高剂量治疗

与假手术组比较,Sin低剂量治疗组比较,

vw

COX-2(个

077.65.52.

P<0.05;n=5

/400倍)6?7.8v

8?7.1*2?5.1*w

P<0.05;与缺血再灌注组比较,*P<0.05;与

4 讨论

Sin是从防己科植物青风藤中提取的生物碱单体,在治疗类

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