用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱

()()用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱

钟筱波　PaulF.Fransz　J.HansdeJong　PimZabel

(荷兰瓦赫宁根农业大学分子生物学系)

HighResolutionPhysicalinsitu　Fransz　J.HansdeJongand　PimZabel

(ofBiology,WageningenAgriculturalUniversity,TheNetherlands)

DNA序列在染色体上的定位和分子图谱(molecularmap)的构建是克隆目的基因的基础。用常规分子生物学技术构建分子图谱是基于对DNA分子标记(molecularmarker),如RFLP、RAPD、ALFP等的遗传分析,从中找出不同DNA序列之间的连锁遗传关系和相关位置。这种分析方法的准确性和图谱的分辨率(resolution)水平将取决于染色体减数分裂时DNA的重组率(meioticrecombination)。但由于重组率在染色体上的分布是不均匀的,Sherman和Stack(1995)发现靠近着丝点(centromere)的异染色质(heterochromatin)区的DNA重组率要比远离着丝点的同染色质(euchromatin)区低很多。这样就会造成两个分子标记之间的遗传距离(geneticdistance)由于在染色体上的位置不同而与真实的物理距离(physicaldistance)发生偏差。因此,人们需要一些更准确的技术来弥补这种偏差。近年来,随着DNA荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,缩写为FISH)的不断发展,一种更直接的,在染色体甚至DNA纤维(extendedDNAfibre)水平上直接构建分子图谱的新方法正不断走向成熟。

DNA荧光原位杂交技术是80年代末才开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记(如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP),然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。FISH技术与其它原位杂交技术相比,除了具有不需要放射性同位素、实验周期短、检测灵敏度高等优点外,还由于它可以用不同的修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针,再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子,因此,可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位,直接得到它们的相关位置和顺序。Ried等(1992)用3种不同标记的核苷酸,以不同的比例混合标记,在人的有丝分裂中期染色体(mitoticmetaphasechromosome)上可以同时检测到7个DNA探针。Dauwerse等(1992)已将FISH技术发展到可同时检测12种DNA探针分子。目前,FISH已成为一种最直接分析DNA序列在染色体或DNA分子上排列的分子细胞遗传学技术。它已被广泛地应用于动植物基因组结构(genomeorganization)的研究和DNA分子物理图谱(physicalmap)的构建(参见Joos等1994,Jiang等1994,Heiskanen等1996的综述)。

在用FISH技术构建DNA分子图谱时,它的分辨率(resolution)是指两个不同DNA探针能够被检测到的最小距离,也是最关键的技术指标。它将决定分子图谱的准确性和精密程度。在决定FISH分辨率的因素中,最重要的是所使用的靶DNA在染色体或DNA纤维上的浓缩度

(condensation),亦即DNA在染色体结构或DNA纤维上的三维空间包裹程度。浓缩度越高,分辨率越低。FISH技术的发展过程也正是分辨率水平由低向高不断进步的历程。

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