蔗糖梯度离心技术方法在提取内质网的应用(2)

），和二喹啉甲酸（蛋白测ＡＰＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄＢＣＡ）　

／定试剂盒均从Ｐｉｅｒｃｅ公司购买。丙烯酰胺Ｎ，Ｎ－／，二甲基甲叉双丙烯酰（ＡｃｒｌａｍｉｄｅＢｉｓＡｃｒｌａｍｉｄｅ－ｙｙ／）、四甲基乙二胺（ＡｃｒＢｉｓｔｅｔｒａｍｅｔｈｌｅｔｈｌｅｎｅｄｉａ－ｙｙ

，、十二烷基磺酸钠（ｍｉｎｅＴＥＭＥＤ）ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｌ　－ｙ，）、，）、甘氨酸（小牛血清白ｓｕｌＨａｔｅＳＤＳＧｌｃｉｎｅＧｌｐｙｙ

，、三羟甲基氨基蛋白（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎＢＳＡ）　　，）、甲烷（脱氧ｔｒｉｓｈｄｒｏｘｍｅｔｈｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅＴｒｉｓｙｙｙ，、、矾酸钠胆酸钠（ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｃｈｏｌａｔｅＤＯＣ）Ｔｒｉｓ　ｙ

（、、、氟化钠（苯ＮａＯＰＧ）ＮａＦ）－磷酸甘油（－３Ｖ４）ββ，、甲磺酰氟（ＨｅｎｌｍｅｔｈｌｓｕｌｆｏｎｌｆｌｕｏｒｉｄｅＰＭＳＦ）　ｐｙｙｙ）、）、胰蛋白酶抑制剂（亮肽酶（胃ａｒｏｔｉｎｉｎｌｅｕｅｔｉｎｐｐｐ）、蛋白酶抑制（二甲基亚砜（ｅｓｔａｔｉｎＤｉｍｅｔｈｌＳｕｌ　－ｐｐｙ，）和尿酸（均购自ＳｆｏｘｉｄｅＤＭＳＯ）ｕｒｉｃａｃｉｄｉｍａ公　ｇ

，。ＤＭＥＭ和胎牛血清（司（ＳｔＬｏｕｉｓＭＯ，ＵＳＡ）ｆｅ　－从Ｇｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）ｉｂｉｃｏ公司购买。免疫　　印迹所用抗体稀释液为含０．０２％ＮａＮ％牛血３的３。硝酸纤维素膜（，清蛋白（ＢＳＡ）ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅＮＣ）为Ｈ冰醋酸、氢氧化钠、ｂｏｎｄ公司产品。醋酸钠、ｙ

氯化钠、蔗糖、高氯酸、硼酸和二甲基甲酰胺均为国产分析纯。１．２　方法

／１．２．１　细胞培养。ＨＥＫ２９３ｗｔ细胞培养基为

［，］

ＤＭＥＭ和１０％ＦＢＳ４５。ＤＭＥＤ用Ｚｅｉｓｓ滤器真空／负压过滤除菌，瓶，ＦＢＳ分装成２０ｍｌ－２０℃保存。细胞在５％ＣＯ３７℃培养箱内培养。每２３ｄ更换～２、细胞达约７传代或培养液１次，０％～８０％丰度时，用于实验。

［６８］

）收集细１．２．２１　蔗糖梯度离心提取内质网～。（，，离心３去胞。用１×ＰＢＳ收集细胞，０００×ｇ２ｍｉｎ　

２０２３

，混匀。［匀浆液配方：胞中加入匀浆液０．５ｍｌ

（），０．２５Ｍ蔗糖，１０ｍＭ　ＴｒｉｓＣＩＨ７．４１ｍＭ醋酸－Ｈｐ／；镁，ＰＭＳＦ０．１７４ｍＬ蛋白酶抑制剂］②手动匀浆ｇ）将破膜的细胞加入到已建立器匀浆３０６０下。（３～好蔗糖密度梯度的离心管上。蔗糖密度梯度的建，，立：由下至上，２Ｍ蔗糖０．２ｍｌ１．３Ｍ蔗糖０．８ｍｌ，。且可以根据１．１６Ｍ蔗糖０．７ｍｌ０．８Ｍ蔗糖０．４ｍｌ／具体离心管的大小，按比例增加减少各层次不同浓度的蔗糖体积。加入时，沿管壁缓慢加入，也可以将以减少冲击力，依中号枪头套在大枪头外缓慢加入，

，。离心１次建立蔗糖密度梯度。（４）０００００×ｇ３ｈ　（）将离心管中的液体由上至下、轻柔地分１５２次等体积取出，分别加入到１做好标记。２个ＥＰ管中，

）／（准备样品。将取出的１６２层液体加入１３体积的，，煮１超声，加入β巯基乙醇和溴芬４×ｂｕｆｆｅｒ０ｍｉｎ

［，０］

。（）。将依次取出的兰煮１０ｍｉｎ７Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ９１　１２管液体等体积上样。孵育一抗内质网特异性抗

／，体Ｂ显色。ｉＧＲＰ７８ｐ２　结果

／运用蔗糖梯度离心技术从ＨＥＫ２９３ｗｔ细胞

（不含ｔ中提取内质网。选用杆状玻璃匀浆ａｕ蛋白）器手动匀浆法破膜后，将破膜细胞加入到已建立好，的蔗糖密度梯度上，离心１不同时间，应０００００×ｇ　用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术检测内质网所在层面。离心　，，内质网分散于蔗糖梯度的不同层面（２ｈ８～１２层））。因为此处介质密度

较低，特别是５图１无７层（～法确定处于此处的内质网是破膜所致的内质网碎还是离心力场不够，使得完整的内质网未沉降、片；

平衡到与自身密度相等的介质中。延长离心时间到、）。内质网聚集于１图２３ｈ发现，０１１和１２层（

）上清。（将收集到的细胞破膜。①将收集到的细２

利用蔗糖梯度离心　　　　　图１　运用蔗糖离心技术提取内质网　　　　　　　　　　图２　通过调整离心时间、

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　技术提取内质网

，）／／图１运用蔗糖梯度离心（技术从ＨＥ不含ｔ中提取内质网，内质网标记物Ｂ１０００００×ｇ２ｈＫ２９３ｗｔ细胞（ａｕ蛋白）ｉＧＲＰ７８被用于检　　注：　ｐ（）。图２运用蔗糖梯度离心（，）／测内质网所在层面，内质网分散于蔗糖梯度的各个层面（技术从ＨＥ８～１２层）Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ１０００００×ｇ３ｈＫ２９３　　／）。不含ｔ中提取内质网，内质网标记物Ｂ为１ｗｔ细胞（ａｕ蛋白）ｉＧＲＰ７８被用于检测内质网所在层面，０、１１和１２层（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ　ｐ

３　讨论

内质网在提取过程中质量控制的关键因素有以下几种。

内３．１　恰当的破膜方法和强度是成功提取细胞器（质网）的关键　目前，用于破碎细胞的方法主要有杆状玻璃匀浆器手动匀浆法、电动匀浆器匀浆法、超声化学裂解法和反复冻融法。其中，杆状玻波处理法、

璃匀浆器手动匀浆法和电动匀浆器匀浆法为细胞破膜提取细胞器的首选。但操作时须注意，由于旋转、与接触器皿摩擦产热可导致细胞或细胞器中活性物质的降解，因此匀浆时须用冷却水降温。超声波发生器可经其较强的冲击和振动产生的剪力致使细胞

但由于其作用力较强，除了打破细胞膜外，也破碎，

易将各细胞器打碎。且超声时大量产热，生物大分子如核酸和酶对超声敏感，一般不宜采用。化学裂、、、解法是在细胞悬液中加入Ｔｒｉｔｏｎ１００ＮＰ４０ＳＤＳ－－去氧胆酸钠使细胞裂解，此方法对细胞内环境破坏较为严重，且往往仍须机械辅助破膜，一般不宜采细胞经反复多次冻融周期（用。反复冻融法，－７０℃或液氮冷冻，不适合用于提取细胞器。３７℃融化）离心力和离心时间是提取高浓３．２　适当的介质、高质量内质网的关键　本方法所采用的蔗糖密度、

度梯度离心是首先利用介质（蔗糖）建立合适的不同介质的最高密度大于被分离组分浓度的介质密度（

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说教育文库蔗糖梯度离心技术方法在提取内质网的应用(2)在线全文阅读。