农杆菌的培养与感受态制备(2)

农杆菌感受态制备：

1）活化原始农杆菌AGL-1菌株于YEB（含50µg/ml羧苄青霉素）平板上，28°C下倒置培养约2d； 2）从上述平板上挑单菌落于约5mlYEB液体培养基内（含50µg/ml羧苄青霉素），于200rpm、28°C振荡培养过夜；

3）吸取1~2ml培养菌液接种到100mlYEB（含50µg/ml羧苄青霉素）中，于200rpm、28°C摇床培养至OD660≈0.5；

4）5000rpm，4°C下离心5min，去上清液，用20ml冰预冷的10%（v/v）甘油重悬菌体，此步骤重复两次；

5）5000rpm，4°C下离心5min，去上清液，用1ml冰预冷的10%（v/v）甘油重悬，每管40µl分装于1.5ml灭菌离心管中，液氮速冻后保存于 80°C备用。

农杆菌电击转化：

用电击法将载体质粒导入根癌农杆菌AGL-1的具体操作为：将5~50ng质粒DNA加入冰浴解冻的农杆菌感受态细胞中混匀，然后转入冰预冷的电击杯中，将其置于电转化仪（Bio-Rad）中脉冲8~12ms。将电击后的农杆菌转入1mlYEB中，于28°C，200rpm摇床培养2~4hr后，5000rpm离心5min收集菌体，弃大部分上清液，用余下液体重悬菌体，混匀后涂布在含相应抗生素（如卡那霉素和羧苄青霉素）的YEB平板上，28°C恒温箱中倒置培养2d左右至抗性菌落出现。

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