基因芯片

肺炎基因芯片结果生物信息学分析

基因芯片(genechip)（又称DNA芯片、生物芯片），最早在80年代中期提出，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于2cm x 2cm 的硅片、玻片等支持物，然后与待测的荧光标记样品的基因按碱基互补配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号强度作出比较和检测，进而获取样品分子的数量和序列信息1-5。基因芯片技术也在1998年被列为年度自然科学领域十大进展之一，目前在实际应用方面，已广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。

生物信息学（bioinformatics）是利用应用数学、信息学、统计学和计算机科学的方法研究生物学的问题。目前的生物信息学基本上只是分子生物学与信息技术（尤其是互联网技术）的结合体。生物信息学的研究材料和结果就是各种各样的生物学数据，其研究工具是计算机，研究方法包括对生物学数据的搜索（收集和筛选）、处理（编辑、整理、管理和显示）及利用（计算、模拟）。目前主要的研究方向有：序列比对、基因识别、基因重组、蛋白质结构预测、基因表达、蛋白质反应的预测，以及建立进化模型。生物学技术往往生成大量的嘈杂数据，与数据挖掘类似，生物信息学利用数学工具从大量数据中提取有用的生物学信息。生物信息学所要处理的典型问题包括：重新组装在霰弹枪定序法测序过程中被打散的DNA序列，从蛋白质的氨基酸序列预测蛋白质结构，利用mRNA微阵列或质谱仪的数据检验基因调控的假说。

本节主要介绍利用生物信息学来分析和处理肺炎基因芯片结果的方法。

第一节 实验所需试剂与仪器

1．RNA样品制备试剂与仪器 TRIzol?试剂（Invitrogen life technologies），Biopulverizer 组织研磨器（biospec），Mini-Bead-Beater-16 研磨珠均质器（biospec） 2. 总RNA纯化及质检试剂和仪器 RNeasy小型试剂盒(Qiagen p/n 74904) ( Buffer RPE缓冲液RPE，Buffer RLT缓冲液RLT，RNeasy小型离心柱)，NanoDrop ND-1000，Baseline-ZERO DNA酶（EPICENTRE, Cat. No. DB0711K） 3. 标记反应试剂盒 快速Amp标记试剂盒，单标（Agilent p/n 5190-0442）

4. 标记/扩增的RNA的纯化和标记cDNA的质量控制试剂盒与仪器 RNeasy Mini Kit (Qiagen p/n 74104)，NanoDrop ND-1000

5. 杂交试剂盒与仪器 Agilent Gene Expression Hybridization Kit (Agilent p/n 5188-5242):10X Blocking Agent, 10X封闭试剂, 25X Fragmentation Buffer, 25X片段化缓冲液, 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM, 2x GEx杂交缓冲液HI-RPM, 杂交室，不锈钢(Agilent p/n G2534A)。杂交室密封垫片基(Agilent p/n G2534-60003) , 杂交炉(Agilent p/n G2545A) ,安捷伦微阵列杂交室用杂交炉旋转器(Agilent p/n G2530-60029)

6. 芯片洗涤试剂盒与仪器 Gene Expression Wash Buffer 1 (Agilent p/n 5188-5325), Gene Expression Wash Buffer 2 (Agilent p/n 5188-5326), Magnetic stir bar (Corning p/n 401435), Magnetic stir plate (Corning p/n 6795-410), Slide-staining dish, with slide rack (Thermo Shandon p/n 121)

7. 扫描仪器 Agilent Microarray Scanner (Agilent p/n G2565BA)

8. Agilent Feature Extraction Software提取数据软件 Agilent Feature Extraction

第二节 实验步骤

一、RNA样品制备

样品分组：1-3正常肺组织(N)，4-6肺炎肺组织(F) 步骤： 1. 匀浆 a. 组织

a)

Biopulverizer冰冻粉碎组织。

? ? ?

将BioPulverizer?置入浅盘并使用液氮充分冷却。 将预冷的组织放入研钵的孔内。

将研钵从浅容器中取出，放置在实验台，用锤子将研杵用力敲一到两下以磨碎组织（59012MS型）。

?

将粉碎物清出以用于进一步的匀浆或提取步骤。

b) Mini-Bead-Beater-16匀浆

?

在2ml螺盖微量离心管中将1.0mm微珠装至一半，然后加入TRIzol和组织，注意要将微量离心管装满。*尽量排除管内的空气。*在匀浆过程中要使用带O形圈的螺盖微量离心管以免产生气雾。*确保在旋上螺盖时口上无微珠。

?

将1到16个微量离心管放在架子上。*如需离心，则需要将它们对称排列。*拧上黑色塑料盖子直至接触到微量离心管管盖顶部。*用手紧固盖子以固定好瓶子。不要过紧。

?

依样品类型定时。启动机器。

b. 贴壁细胞

直接在3.5cm直径培养皿里加入1ml TRIzol试剂以裂解细胞，并用移液管吹吸细胞裂解液几次。TRIzol试剂的加入量由培养皿的面积（1ml每平方厘米）而非细胞的量决定。 c. 悬浮细胞

细胞离心的沉淀加入TRIzol试剂并用移液管反复吹吸以裂解细胞。每5-10 × 10动物植物或酵母细胞或每1 × 10细菌细胞使用1ml的TRIzol试剂。在TRIzol试剂加入前不要洗涤细胞以免增加mRNA降解的可能。破碎一些酵母和细菌的细胞也可能需要匀浆。 2.

两相分离

已加TRIzol的样品于15到30°C放置5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1 ml的TRIzol试剂匀浆的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30°C孵育2到3分钟。4°C下12,000 ×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIzol试剂的60%。 3.

RNA沉淀

将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1 ml TRIZOL试剂的此时加0.5 ml的异丙醇。混匀后15到30°C孵育10分钟后，于4°C 12,000 ×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 4.

RNA清洗

移去上清液，每1 ml TRIzol试剂匀浆的样品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4°C 7,500 ×g离心5分钟。 5.

重新溶解RNA沉淀

最后，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260 / 280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60°C孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于- 70°C。

二、总RNA纯化及质检 操作前注意事项： 1.

RPE缓冲液是以浓缩液的形式提供的，第一次使用前，按瓶上所述加入4倍体积的96-100%乙醇配成工作溶液。 步骤： 1.

将以下组分在微量离心管中混合： 重新溶解的RNA 10×反应缓冲液

≤85ul 10ul

7

6

Baseline-ZERO DNA酶 无RNA酶的水 总体积 2. 3. 4. 5.

37°C孵育30分钟。

加入350 μl 缓冲液RLT，混匀。

5ul X ul 100ul

加入250 μl 乙醇 (96–100%)，吸打混匀。无需离心，立即转入步骤5。

把700 微升的样品加入到安装在2毫升收集管上的RNeasy小型离心柱中，小心地盖上盖子，≥8000 x g 离心15s，弃去流体。

6. 在RNeasy小柱中加入500 μl缓冲液RPE，小心地盖上盖子，≥8000 x g离心15s，洗涤RNeasy膜，弃去流体。

7. 8. 9.

再次加入500 μl缓冲液RPE，盖上盖子，≥8000 x g离心2min洗涤RNeasy膜。 把RNeasy柱放在一新的2ml的收集管中，用过滤法去除旧的收集管，全速离心1分钟。

RNeasy柱转移到一新的1.5毫升的离心管中，吸取适量无RNA酶的水（请参考“RNA-QC”报告）直接加入到RNeasy膜中。盖上管盖，≥8000 x g离心1分钟、洗脱。

10. RNA定量和质量控制（请参考“RNA-QC”报告） 三、标记反应 操作步骤： 1. 2. 3. 4. 5. 6.

将1μg总RNA加入到一支1.5ml的微量离心管中。 加入1.2μl的T7 Promoter引物 加无核酸酶的水至总反应体积11.5μl

将反应体系置65°C循环水浴10分钟使引物和模板变性。 将反应体系置冰上并静置5分钟。

将下表所列组分按顺序加入并轻轻混合以配置成cDNA Master Mix，置冰上，现配现用。

5×First Strand Buffer 0.1M DTT 10mM dNTP mix MMLV-RT RNaseOut Total volume 7. 8. 9.

Volume(ul) per reaction

4 2 1 1 0.5 8.5

将每样品管在微量离心机中简单甩一下，使管壁和管盖上的溶液离心下来。将离心管放回冰上。 在每样品管中加入8.5μl的cDNA Master Mix并上下吹吸混合。 将样品于40°C循环水浴中温育2小时。

10. 将样品转至65°C循环水浴中温育15分钟。 11. 将样品转至冰上并静置5分钟。

12. 将每样品管在微量离心机中简单甩一下，使管壁和管盖上的溶液离心下来。

13. 将下表所列组分按顺序加入并在室温轻轻吹吸混合以配置成Transcription Master Mix，现配现用。

Nuclease-free water 4X Transcription Buffer

Volume(ul) per reaction

15.3 20

0.1 M DTT NTP mix 50% PEG RNaseOUT

Inorganic pyrophosphatase T7 RNA Polymerase Cyanine-3-CTP Total volume

6 8 6.4 0.5 0.6 0.8 2.4 60

14. 在每样品管中加入60μl Transcription Master Mix。轻轻吹吸混匀。 15. 将样品于40°C循环水浴中温育2小时。

四、标记/扩增的RNA的纯化和标记cDNA的质量控制 操作步骤： 1. 2. 3. 4.

加入20μl无核酸酶的水至cRNA样品中至总体积100μl 加入350μl的RLT缓冲液并吹吸充分混匀

加入250μl的乙醇（纯度100%）并吹吸完全混匀。不要离心。

将700μl的cRNA样品加入到一支放在2ml收集管内的RNeasy小柱中， 样品在4°C以1,3000 rpm离心30秒。弃流穿液与收集管。 5.

将RNeasy柱转移至一新收集管并在其中加入500μl的RPE缓冲液(含乙醇)。样品在4°C以1,3000 rpm离心30秒。弃流穿液，收集管则重复使用。 6.

将RNeasy柱中再加入300μl的RPE缓冲液(含乙醇)。样品在4°C以1,3000 rpm离心60秒。弃流穿液与收集管。 7.

将RNeasy柱转移至一支新的1.5ml收集管中，直接在RNeasy滤膜上加入适量的无RNA酶的水（请参考报告‖Labeling Efficiency-QC‖）以溶解纯化的cRNA样品。静置60秒，然后在4°C以1,3000 rpm离心30秒。 8.

将含有cRNA样品的流穿液放置在冰上，弃RNeasy柱。

9. T每样品取1.5μl用NanoDrop ND-1000测定产物量特异性活性(请参考报告‖Labeling Efficiency-QC‖)

? ? ? ?

在主菜单上选择MicroArray Measurement。进入Sample Type pull-down菜单选择DNA-50。 使用1.5μl 1x的标记液为仪器调零。

使用1.5μl纯化的标记的基因组DNA定量。测定A260nm(DNA)和A550nm(cyanine 3)吸光值。 标记的基因组DNA的特异性活性(pmol染料每μg基因组DNA)可用下式算得：

(Concentration of Cy3)

Specific Activity =——————————————— = pmol Cy3 per μg cRNA

(Concentration of cRNA) * 1000

Cy3的浓度

特异性活性 =—————————— = pmol Cy3 每 μg cRNA

cRNA的浓度*1000

* I如果量小于1.65 μg且特异性活性小于9.0 pmol Cy3每μg cRNA，则不要进行杂交。再次制备cRNA

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