沙门氏菌检验

作业指导书 文件名称：沙门氏菌检验方法 文件编号：YCCDC/BZFF06-2016 第1页共7页 第 1 版第 0 次修改 生效日期：2016年6月6日 沙门氏菌检验

1. 范围

本法适用于食品中沙门氏菌的检验。 2. 设备和材料

处微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：2℃～5℃。

2.2 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 2.3 均质器。 2.4 振荡器。

2.5 电子天平：感量0.1g。

2.6 无菌锥形瓶：容量500mL，250mL。 2.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.8无菌培养皿：直径90mm。

2.9 无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。 2.10 无菌毛细管。

2.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.12 全自动微生物生化鉴定系统。 3. 培养基和试剂

3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）。

3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液。 3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。 3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂。 3.5 HE琼脂。

3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。 3.7沙门氏菌属显色培养基。 3.8 三糖铁（TSI）琼脂。 3.9 蛋白胨水、靛基质试剂。 3.10 尿素琼脂（pH7.2）。 3.11 氰化钾（KCN）培养基。 3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基。 3.13 糖发酵管。

3.14 邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）培养基。 3.15 半固体琼脂。 3.16 丙二酸钠培养基。

3.17 沙门氏菌O和H诊断血清。 3.18 生化鉴定试剂盒。 4. 检验程序

沙门氏菌检验程序见图1。

作业指导书 文件名称：沙门氏菌检验方法 文件编号：YCCDC/BZFF06-2016 第2页共7页 第 1 版第 0 次修改 生效日期：2016年6月6日 36℃±1℃，18h～24h 检样 25g（mL）样品+225mLBPW 1mL+TTB 10mL 1mL+SC 10mL 42℃±1℃，18h～24h 36℃±1℃，18h～24h XLD（或HE、显色培养基） BS 36℃±1℃，40h～48h 36℃±1℃，18h～24h 挑取可疑菌落 TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素（pH7.2），KCN H2S＋靛基质－H2S＋靛基质－H2S－靛基质－生化鉴定试剂盒或反应结果 尿素－KCN－ 尿素－KCN－ 尿素－KCN－ 全自动微生物生化与左侧描 赖氨酸＋ 赖氨酸＋ 赖氨酸＋/－ 鉴定系统+ 述不符 甘露醇＋、山梨醇＋ ONPG－ 非沙门氏菌 沙门氏菌，血清学实验

图1 沙门氏菌检验程序

报告 作业指导书 文件名称：沙门氏菌检验方法 文件编号：YCCDC/BZFF06-2016 第3页共7页 第 1 版第 0 次修改 生效日期：2016年6月6日 5. 操作步骤 5.1 前增菌

称取25g（mL）样品放入盛有225mL BPW 的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2.无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。

如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃～5℃不超过18h解冻。 5.2 增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mL TTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL转种于10mL SC内，于36℃±1℃培养18h～24h。 5.3 分离

分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。与36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD平板、HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。

表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板 BS琼脂 沙门氏菌 菌落为褐色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可成黑色或棕色；有些菌株成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 HE琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。 XLD琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 沙门氏菌属显色培养基 按照显色培养基的说明进行判定。

5.4 生化试验

5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可以菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种懒氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。

表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

三糖铁琼脂 斜面 K K A A 底层 A A A A 产气 硫化氢 ＋ － ＋ － 懒氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断 可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 非沙门氏菌 ＋（－） ＋（－） ＋（－） ＋（－） ＋（－） ＋（－） ＋/－ ＋/－ 作业指导书 文件名称：沙门氏菌检验方法 K K ＋/－ ＋/－ 文件编号：YCCDC/BZFF06-2016 第4页共7页 第 1 版第 0 次修改 生效日期：2016年6月6日 ＋/－ 非沙门氏菌 注：K：产碱，A：产酸； ＋：阳性，－：阴性； ＋（－）：多数阳性，少数阴性； ＋/－：阳性或阴性。 5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备比必要时复查。

表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

反应序号 A1 A2 A3 硫化氢（H2S） ＋ ＋ － 靛基质 － ＋ － pH7.2尿素 － － － 氰化钾（KCN） － － － 懒氨酸脱羧酶 ＋ ＋ ＋/－ 注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。 5.4.2.1 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和懒氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。

表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH7.2尿素 － － ＋ 氰化钾（KCN） － ＋ － 懒氨酸脱羧酶 － ＋ ＋ 判定结果 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特征） 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：＋表示阳性；－表示阴性。 5.4.2.2 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

5.4.2.3 反应序号A3：补做ONPG。ONPG隐形为沙门氏菌，同事赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

5.4.2.4 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。

表5 沙门氏菌属生化群的鉴别 项目 卫矛醇 山梨醇 水杨苷 ONPG 丙二酸盐 KCN Ⅰ ＋ ＋ － － － － Ⅱ ＋ ＋ － － ＋ － Ⅲ － ＋ － ＋ ＋ － Ⅳ － ＋ ＋ － － ＋ Ⅴ ＋ ＋ － ＋ － ＋ Ⅵ － － － － － － 注：＋表示阳性；－表示阴性。 5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统，可根据5.4.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒

作业指导书 文件名称：沙门氏菌检验方法 文件编号：YCCDC/BZFF06-2016 第5页共7页 第 1 版第 0 次修改 生效日期：2016年6月6日 或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.5 血清学鉴定 5.5.1 抗原的准备

一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

O血清不凝集时，讲菌株接种在琼脂量较高的（如2%～3%）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55%～0.65%半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小试管1次～2次，自远端取菌培养后再检查。 5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定

再玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定

同5.5.2。

5.5.4 血清学分型（选做项目） 5.5.4.1 O抗原的鉴定

用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。

被A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。

不被A～F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：

O多价1 A，B，C，D，E，F群（并包括6,14群） O多价2 13,16,17,18,21群 O多价3 28,30,35,38,39群 O多价4 40,41,42,43群 O多价5 44,45,47,48群 O多价6 50,51,52,53群 O多价7 55,56,57,58群 O多价8 59,60,61,62群 O多价9 63,65,66,67群 5.5.4.2 H抗原的鉴定

属于A～F各O群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2项的H抗原。

表2 A～F群常见菌型H抗原表

O群 第1相 第2相

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