从腐烂的柑橘中分离酵母菌并计数

从腐烂的柑橘中分离酵母菌并计数

摘要：酵母菌与人类的关系极其密切，例如酒类的生产，面包的制作等都离不开酵母菌。酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸性环境，如各种水果的表皮、发酵的果汁、蔬菜、花蜜、等。因此本次实验使用马铃薯培养基，从腐烂的柑橘果皮来提取分离酵母菌。从腐烂柑橘的表皮挑取少量菌种，使用平板划线的方法在平板上接种，28 ℃培养48h后观察菌落并镜检，进行第二步纯化：选出酵母菌菌落再进行下一步接种，28℃培养24h后将菌接入斜面保存。最后使用分离出的酵母菌用血球计数板进行计数。 关键词：酵母菌；柑橘；分离；计数

1 方法

1.1 样品来源

在广西师大四期水果店内购买的柑橘，待其自然腐烂。

1.2 培养基和试剂

1.2.1试剂和药品

马铃薯80g，蔗糖8g，琼脂6~8g，蒸馏水410ml。

1.2.2马铃薯培养基

（1）称量：80g马铃薯，8g蔗糖，6-8g琼脂，正确称取放于搪瓷杯中；（2）

溶化：在搪瓷杯中加入410ml水，用玻璃棒搅匀，加热溶解；（3）趁热分装到2个三角烧瓶中，三角烧瓶容积不超过1/2为宜；（4）加塞。分装完毕后在三角烧瓶上加上棉塞；（5）包扎。加塞后将瓶口用牛皮纸扎好 ，用麻绳以活结的形式包扎；（6）标注；（7）灭菌。放入高压蒸汽灭菌锅中以0.1MPa,121℃,30min灭菌。

1.3 实验仪器

三角烧瓶，烧杯，量筒，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，牛皮纸，旧报纸，记号笔，麻绳，电磁炉，玻璃棒，培养皿（6套一包），高压蒸汽灭菌锅，紫外线灯，电热干燥箱，注射器，镊子，无菌玻璃涂棒，分装器，电子秤，棉塞，橡胶塞，

1

无菌吸管，接种环，接种针、显微镜，载玻片，酒精灯，吸水纸，搪瓷杯。

1.4 实验步骤

1.4.1 从腐烂柑橘果皮中分离提取酵母菌

1.4.1.1

材料准备

将实验所需要的试管、锥形瓶等玻璃仪器用牛皮纸包扎好与培养基一起放入高压蒸汽灭菌锅内，设置 温度121℃时间30分钟，同时将培养皿放入干热灭菌箱中设置160℃时间120分钟，同时准备试验中所需要的材料。 1.4.1.2

倒平板

将灭菌后取出的培养皿和配置的培养基移至超净工作台中，将培养基趁热倒入培养皿中，然后将培养皿静置使培养基凝固；再将剩余的培养基分别倒入2支灭菌后的试管中（体积约为试管的1/3），加塞，倾斜于桌面静置使其凝固成斜面培养基。 1.4.1.3接种培养

从橘子皮样品上直接刮取一定量菌接种于经灭菌处理的平板培养基上，使用平板画线法（无菌条件下操作），28℃恒温箱中培养48h后观察。 1.4.1.4纯化

待平板上长出菌落后，选取菌落均匀的菌。在分离培养基上进行划线，待划线结束后，将培养皿倒置于28℃恒温下培养24h，继续观察马铃薯培养基上长出的菌落以及出现的现象即可得到酵母菌。 1.4.1．5镜检

从分离的平板上单个菌落挑取少许菌苔涂在载玻片上，在显微镜下观察细胞个体形态，结合菌落形态，综合分析，本次所分离出的为纯净的酵母菌。 1.4.1.6 保存

确认所培养的酵母菌纯化后，取纯的酵母菌接至斜面培养基，置于28℃恒温下培养24h后保存。

1.4.2 酵母菌的计数

1.4.2.1 材料准备

血球计数板，试管，蒸馏水，无菌的毛细滴管，显微镜

2

1.4.2.2 菌悬液的制备

取十毫升的蒸馏水于试管中，用无菌接种环在斜面上轻轻刮取后放入试管中混匀。

1.4.2.3 检查血球计数板

在加样前，对血球计数板的计数室进行镜检，若有污物可用自来水冲洗，再用95%的酒精棉球轻轻擦洗，最后用吸水纸吸干。 1.4.2.4 加样品

摇匀菌液，将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，再用镊子轻压盖玻片，以免因菌液过多将盖玻片顶起而改变了计数室容积。加样后静置5分钟，使细胞自然沉降。 1.4.2.5显微镜计数

将加有样品的血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。每个计数室选四个角和中央的一个中格中的菌体进行计数（位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的），并记录。

设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则： 1ml菌液中的总菌数=A/5×25×104×B

2.结果

显微计数结果如下表

各中格菌数 1 189 2 263 3 292 4 275 5 303 1322 1 6.61×107/ml A B 菌数/ml 表1 显微计数结果

3.实验结果与分析

酵母菌适合长在含糖质较高的偏酸环境，因此可以在腐烂的柑橘果皮上分

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离，并在马铃薯培养基上培养。通过显微技术法可以计算出本次分离出的酵母菌数为6.61×107/ml。

参考文献：

1.微生物实验（第四版）沈萍、陈向东 高等教育出版社 2.微生物学教程（第三版）周德庆 高等教育出版社

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