制药工艺学作业 - 肝素

-肝素

（化学化工学院 制药102班：王俊超 学号：20100934204）

1. 摘 要

肝素是一类结构异常复杂的糖胺聚糖混合物，因具有多种生物学功能，其提取纯化方法一直是各国学者研究的热点。

2. 关键词

肝素，提取，分离纯化

肝素是哺乳动物体内含的一种粘多糖，它与蛋白质结合在一起存在于肠粘膜、肺、肝等器官内，肝素与蛋白质分离提取后，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防止动脉粥样硬化，心脑血管疾病的显效药物。

3. 肝素的结构：

生物体内的肝素总是与蛋白质结合成复合体，此复合体无抗凝血活性或其他生物活性，肝素的活性才能表现出来所以肝素的制备一般包括肝素—蛋白复合物的提取，肝素—蛋白复合物的分解和肝素的分级分离三步。我国是世界上肝素的主要出口国之一,但长期以来以生产粗品肝素为主，产品普遍存在收率差成本高等问题。因此，研究肝素的高效提取纯化工艺技术非常重要。

4. 肝素的提取方法

4.1 盐析提取法

盐析法是国内常用的肝素提取方法，其基本原理是利用蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度降低而沉淀的现象。操作方法是先用碱性溶液将肝素从肝素—蛋白复合物中分离，然后利用盐析法除去蛋白质，经吸附、洗脱、乙醇沉淀、丙酮干燥等传统工序后得肝素粗品。该方法的优点是操作简单，成本低廉，缺点是蛋白质不能完全除去。

4.2 酶解提取法

传统的酶法提取是利用蛋白酶将肝素中的杂蛋白降解为小分子肽，从而使肝素分子脱离，最后通过调节pH，热变性和盐析除去酶蛋白和被降解的蛋白质制得肝素 目前已使用的酶有胰蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等。应用此法可以简化浓缩工艺和后续的脱蛋白工艺，且可提高肝素粗品的得率和蛋白的脱除率。李红心[1]将酶解结合氧化法精制肝素钠与二次氧化法进行了对比，结果表明，酶解结合氧化法所得产品较白，且单位效价和效价回收率均高于二次氧化

法，效价提高6U/mg，效价回收率提高5% 宋大巍等[2]对胰蛋白酶水解提取肝素的工艺参数进行了研究，在最优工艺参数：酶水解温度55 ，酶水解时间2h，料液比1：1.5条件下，肝素得率理论值为211.34mg kg-1，验证实验得率为206.83mg kg-1。程林坤等[3]报道了从牦牛肺中提取肝素钠的工艺条件，其通过正交实验确定的优化条件为：木瓜蛋白酶1 500，酶解时间3h，胰蛋白酶1 200，过氧化氢1%，条件优化后产品效价为131U/mg，产率可达1.92%。最新的研究方法趋向于寻找特定的酶对肝素进行酶降解， Linhardt等[4]的报道指出，利用肝素酶来合成肝素及其衍生物是可以实现的。 Toida等[5]的研究表明，采用肝素酶法制备的肝素寡糖（即低分子肝素）结合抗凝血酶Ⅲ能力和肝素一样，且同样具有强抗凝血能力。

4.3 超声波提取法

超声波提取法是利用超声波对细胞组织的破碎作用来提高糖类在提取液中的溶解度和浸出率，从而有利于提高糖的提取率。超声波提取有不需加热提取率高、对生物活性影响小、溶剂用量少等特点。

张丽萍等[6]对超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺进行了研究，结果表明，在超声功率300W，超声温度40℃ ，超声时间40min，液料比为15mL/mg条件下肝素得率最高，达0.0184%，比盐析法的得率提高了10%以上，且节省提取时间2h左右。宋大巍[7]的研究结果则表明，酶水解法结合超声波辅助盐析，提取率可达230.81mg/kg，比传统的盐析方法提高40%。另有报道，超声波辅助酶解法提取猪小肠肝素[8]。罗时通[8]研究了复频组合超声强化双酶法提取肝素钠的技术，在该技术条件下产品收率可提高29.6%，效价稳定在120U/mg以上，并可节约三分之一的时间。

5. 肝素的分离纯化

粗品肝素中往往含有其它粘多糖，也含有大量未除尽的蛋白质和核酸类物质，因此严重影响肝素的品质。传统的肝素纯化方法有高锰酸钾氧化法、过氧化氢氧化法和组合氧化法，但无论是哪一种氧化方法，都会对肝素结构造成不同程

度的破坏。随着现代分离分析技术的发展，一些简洁高效的生化分离技术逐渐被应用于肝素的分离纯化，不同的肝素组分被分离出来并研究它们的结构和生物活性，使研制不同功能活性的肝素医药制品成为可能[9]。

5.1 凝胶过滤层析

凝胶过滤层析（凝胶层析或分子筛层析）主要是利用具有三维网状结构的多孔性凝胶进行多糖分离。当含有混合溶质的溶液流经凝胶柱时，小分子组分容易扩散进入孔中，而大的则不易进入。在洗脱过程中，溶质组分按相对分子量由大到小的顺序依次流出，从而实现多糖的分离纯化。

目前已商品化的凝胶过滤介质分为单一基质型和复合型，前者主要有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和聚苯乙烯-二乙烯苯凝胶等，后者有葡聚糖-琼脂糖混合凝胶、琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等[10]。Viskov等[11]发明了一项低分子量肝素制备技术，将肝素溶液经过Q-琼脂糖凝胶柱和G10葡聚糖凝胶过滤纯化，最后收集冻干，收益率可达87%。

5.2 离子交换层析

离子交换层析的原理是同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合 如肝素是聚阴离子，它与阴离子交换剂上的阴离子竞争，发生离子交换后被吸附到交换剂上，之后可通过不同浓度的洗脱液分级分离肝素Piepkorn等[12]利用DEAE-sephadex和protamine-sepharose两种离子交换剂对商品肝素进行了分离纯化，结果表明，纯化所得肝素效价分别为289U/mg和286U/mg，几乎是原肝素的两倍；经Sephadex G-100凝胶过滤分析发现肝素分子量与抗凝血活性有直接关系 Limtiaco[13]等应用弱阴离子交换层析法耦合在线紫外光谱和核磁共振检测技术对肝素的杂质进行了分离和结构鉴定。

Doneanu等[14]也报道了阴离子交换层析法应用于肝素钠中杂质的检测，利用SpherisorbSAX系列的离子交换剂能够有效地将硫酸软骨素与肝素高效分离。

5.3 亲和层析

亲和层析法分离肝素是将具有特异性亲和力的分子作为配体固定在固相载

体上，并置于层析柱中，当提取液通过层析柱时，与此配体具有亲和性的组分就从样品液中被吸附到柱上，从而实现了肝素组分的分离纯化。Schmer等[15]研发了鱼精蛋白偶联琼脂糖作为亲和吸附剂纯化的方法，将氯化钠-咪唑洗脱缓冲液分为1.3 -1.4， 1.4 -1.7， 1.7 -1.9， 1.9 -2.0mol/L四个梯度进行分级洗脱，结果表明，1.7- 1.9mol/L的缓冲区，分离所得肝素一般效价范围是210 -260U/mg，1.9- 2.0mol/L缓冲区约为270-305U/mg。Hook等[16]研究了亲和层析法固定抗凝血酶分离高活性和低活性肝素组分，研究发现效价为190U/mg的样品肝素，分离后效价区间为19-285U/mg。

5.4 其他方法

Eldridge等[17]利用毛细血管电泳法对肝素二糖进行了分离，并对其结构进行了H-核磁共振分析。Liang等[18]研究了肝素寡糖的毛细血管电泳分离法，并分析了其与粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的相互关系，结果表明较大的低聚糖能与G-CSF互动，但没有观察到较小的低聚糖与G-CSF的结合， G-CSF和肝素之间的相互作用与肝素链的长度有关。Volpi等[19]也对毛细血管电泳法在肝素的分离分析中的应用进行了报道。Thanawiroon等[20]首次研究了反相高效液相色谱法分离肝素衍生寡糖混合物，研究发现在优化条件下可获得超过30个低聚糖组分，且分析时间不到30min，这也使得反相高效液相色谱法分离与质谱分析联合使用成为可能。Kerns等[21]应用反相高效液相色谱法成功分离出了具有羟基保护的肝素衍生双糖。

本文仅对肝素的国内常用的提取法：盐析提取法和常用的精制肝素法：酶解结合氧化法进行详细的介绍。

6. 肝素盐析提取法工艺

6.1 盐解

将刮好的新鲜肠粘膜，每100斤肠粘膜加入清水100斤，按肠粘膜和水的总重量，加入4%的工业盐，搅拌均匀，再加烧碱液调PH值为8--9，缓慢升温50--55度，加温时每10--20分钟加水搅拌一次，恒温2小时，注意要间隔搅拌。恒温

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