河八王分蘖基因NpD53克隆及其生物信息学分析(2)

　　由图1可知，总RNA的28S和18S条带明亮、清晰、完整，无其他杂质污染，说明提取的河八王幼嫩叶片总RNA质量较好，可用于后续试验。

　　PCR扩增NpD53基因，其测序结果显示，NpD53基因的中间序列长度760bp，5’端序列长度1497bp，3’端序列长度1233bp，经ContigExpress软件拼接后，其cDNA序列全长为2597bp。

　　2.2NpD53基因同源性比对及系统进化树分析

　　将克隆获得的NpD53基因cDNA序列提交至NCBI数据库中进行核苷酸序列比对，结果显示，该序列与高粱（Sorghumbicolor）（XIVl002441614.2）、玉米（ZeamarsL_）（KUl31574.1）和水稻（Orvzasativa）（KF709434.1）的D53基因核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和77%，说明本研究克隆获得的基因为河八王分蘖基因D53。利用ORFFinder找到NpD53基因的ORF编码区（238-2364bp），长度为2037bp，编码678个氨基酸，其中5’非编码区长度为237bp，3’非编码区长度为233bp（图2）。

　　NpD53基因编码蛋白（NOD53）与高粱（XP002441659.1）、山羊草（Aegilopstauschii）（XP02016-8048.1）、小麦（Triticumaestivum）（ARB18226.1）和海枣（Phoenixdactylifera）（XP008805019.1）D53蛋白的氨基酸序列同源性分别为91%、63%、59%和39%。利用MEGA6.0进行氨基酸多序列比对，结果（图3）显示，NpD53与禾本科物种具有较高的同源性，其中与高粱的2个D53蛋白同源性最高，分别为91%和85%，而与海枣、油棕（Elaeisguineensis）、芭蕉（Musaacuminatasubsp.malaccensis）等物种的同源性仅30%-40%，说明河八王与海枣、油棕、芭蕉等物种的亲缘关系较远，而与高粱的亲缘关系较近。

　　2.3NOD53蛋白的理化性质及亲/疏水性预测结果

　　NpD53蛋白的理化性质及亲/疏水性预测结果显示，该蛋白分子式为C3226H5162N96401034532，分子量为75.02kD，由678个氨基酸组成，其中包含负电荷氨基酸残基86个和正电荷氨基酸残基82个，丝氨酸含量最高，达13.0%；理论等电点（pI）为6.59，为酸性蛋白质；亲水性平均数为-0.506，有较多区段位于0分以下，以亲水性为主（图4），表明其为亲水性蛋白；不稳定系数为54.83，半衰期约为30h，说明其为不稳定蛋白。

　　2.4NOD53蛋白的功能结构域预测结果

　　利用NCBIBLAST-E具预测NOD53蛋白的结构域，结果（图5）显示，该蛋白存在P-loopNTPase和ClpBD2-small超家族核心序列，含有4个非特异性位点：ClpA、AAA2、ⅥClpVl和ClDC。与图3中的其他物种均具有相同的保守结构域ClpBD2-small。

　　2.5NOD53蛋白的二级结构和三维结构分析

　　NpD53蛋白的二级结构预测结果（表2）显示，该蛋白的二级结构仅有4种卷曲类型，其中无规则卷曲最多，占42.77%，其次是α-螺旋，占35.55%，延伸链和β-转角分别占15.34%和6.34%。NpD53蛋白跨膜结构预测结果显示，该蛋白无跨膜结构域。NpD53蛋白三维结构如图6所示，同源模型为MecA-ClpC复合物（3j3u.1），但同源性较低，仅19.3%。NpD53蛋白的亚细胞定位预测结果显示，该蛋白位于细胞核内，可信度94.1%。

　　3讨论

　　独脚金内酯属类胡萝卜素植物激素，Jiang等（2013）、Zhou等（2013）研究发现，在水稻中D53蛋白为独脚金内酯信号转导途径的抑制因子，Liu等（2017）发现D53基因在小麦分蘖和穗数上起一定的调控作用。本研究首次从河八王中克隆得到NpD53基因，可为后续河八王分蘖机制研究打下理论基础。

　　应用RACE技术可对mRNA末端进行快速扩增，具有快速、稳定和成功率高等优点，是有效获取cDNA全长的有效手段之一（唐克轩等，2002）。本研究采用RACE技术克隆获得河八王NpD53基因，其具有完整的ORF，其编码蛋白NpD53的氨基酸序列与其他物种的D53蛋白具有相同的保守结构域clpBD2-small，与禾本科物种的同源性较高，其中与高梁的2个D53蛋白同源性最高，分别为91%和85%，而与海枣、油棕、芭蕉等物种的相似性仅30%-40%，说明不同物种问的D53蛋白可能有不同的结构和功能。ClpB是HSP100/Clp蛋白家族的一员，与细胞的耐热性紧密相关，可溶解热胁迫下的蛋白聚集体，从而减少热激对细胞产生的损害，其序列具有高度保守特性（Katiyar-Agarwaletal.，2003）。其中胞质型HSPl01/ClpB蛋白是植物抗高温必需的因子，推测HSPl01/ClpB转基因水稻有较高的耐热性（Katiyar-Agarwaletal.，2003；杨金莹等，2006）。由此推测河八王中的ClpB也与植株的自身耐热性有关。

　　已有研究证实，D53蛋白与I类ClpATP酶类有相似的结构（Zhouetal.，2013），ClpATP酶是细菌中高度保守的调节亚基，是一种分子伴侣，其自身无水解活性，其中I类ClpATP酶类带有2个不同的ATP结合区域（Freesetal.，2007）。本研究河八王NpD53蛋白序列中的非特异性位点ClpA和ClpC属于I类，由此推测NpD53蛋白为一种分子伴侣，与河八王的自身耐热性相关。

　　4结论

　　从河八王中克隆获得的分蘖基因NpD53，其编码蛋白NpD53与其他物种的D53蛋白具有相同的保守结构域，并具有2个I类ClpATP酶的非特异性位点，由此推测NpD53蛋白为一种分子伴侣，与河八王自身的耐热性相关。

　　作者：刘昔辉等

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