放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究 - 图文(8)

放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

2.2.10.2.4 洗脱和产物处理

依次用石油醚∶异丙醇9∶1、7∶3、5∶5、2∶8，4个梯度进行洗脱，流速为1mL/min，每5mL收集1管，采用琼脂扩散法以烟草青枯病菌为指示菌对各部分分别进行抑菌活性测定，合并活性部分后减压浓缩。

2.2.11 硅胶薄层色谱制备抑菌活性物质

2.2.11.1 硅胶薄层色谱展层条件筛选

按照

2.2.10.1.1中的方法制作硅胶薄板，以2.2.10.2.4中分离得到的

抑菌活性物质为上样样品，点状点样，展开剂依次选择石油醚∶异丙醇∶甲醇（V/V/V）为15∶1∶0.1、13∶1∶0.1、10∶1∶0.1、10∶1∶0.3、10∶1∶0.5、10∶2∶0.5进行测试以选出薄层层析的最佳展开剂。展开前将硅胶板两侧刮掉1cm以防止边缘效应，点样量为20μL，在密闭的层析缸中上行展层，254nm紫外灯下观察分离效果。 2.2.11.2 薄层色谱法制备抑菌活性物质

采用2.2.11.1中的方法，只是将点样量调整为100μL，以2.2.11.1中选出的最佳展开剂上行展层，观察斑点分离情况，并配合抑菌活性测定（周德庆，1986），以烟草青枯病菌为指示菌，将有抑菌活性的斑点刮下，合并多次薄层层析所得的活性斑点处的硅胶粉后，用甲醇浸提。于12000r/min离心10min，有机滤膜（0.22μm）抽滤，收集上清液后旋转蒸发并干燥，获得抑菌活性物质。

2.2.12高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测活性物质的纯度

2.2.12.1样品处理

用色谱甲醇溶解由2.2.11.2制备的待测样品，经配备有机微孔滤膜（0.22μm）的细菌过滤器过滤，备用。

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2.2.12.2活性物质的全波长紫外检测

将待上样样品用全波长紫外可见分光光度计在紫外光区(200nm至400nm)进行全波长紫外扫描，测定其最大吸收波长，根据全波长紫外扫描确定高效液相色谱的紫外检测波长。 2.2.12.3 高效液相色谱洗脱条件筛选

色谱柱：EclipseXDB_C18，5μm，4.6mm×150mm。流动相选择常用的甲醇（色谱级）—水（超纯水）系统，两溶剂先用微孔滤膜（0.22μm）抽滤，超声波脱气，流动相比例分别为20：80、40：60、50：50、60：40；柱温为30℃；流速1mL/min；以2.2.10.2.4中分离得到的抑菌活性物质为样品上样，进样量20μL；以2.2.12.2中得到的最大紫外吸收波长检测。

观察不同流动相色谱峰的数量、色谱峰峰形和基线平稳状况，根据基线平稳、色谱峰数、峰形状况等原则（李发美，1999），选择一个最佳流动相比例，作为高效液相色谱法检测抑菌活性物质纯度时的流动相。

2.2.12.4 高效液相色谱法检测纯度

以

2.2.12.3中选出的最佳流动相为洗脱流动相，将由2.2.11.2制备的

抑菌活性物质用甲醇（色谱级）溶解，经过0.22μm有机膜过滤后再经超声波脱气10min，在2.2.12.3的色谱条件下，以色谱级甲醇为对照，根据出峰的情况检测样品的纯度。

2.2.13捷克八溶剂系统纸色谱

捷克八溶剂系统（周德庆，1986）：①水饱和的正丁醇；②水饱和的正丁醇，内含2%对甲苯磺酸；③正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1；④水饱和的正丁醇，内含2%六氢吡啶；⑤以正丁醇饱和的0.5mol/L、pH7的磷酸缓冲液；⑥正丁醇饱和的水，内含2%对甲苯磺酸；⑦苯∶甲醇=4∶1，所用滤纸先用0.5 mol/L pH7的磷酸缓冲液处理，晾干后使用；⑧甲醇∶水=3∶1，水中含3%氯化钠，所用滤纸先用5%硫酸钠处理，晾干后使用。

以分离纯化的菌株Y23拮抗产物为上样样品，层析完成后以烟草青枯病菌为指示菌，用生物学测定法确定活性物质分布位置。

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2.2.14 pH纸色谱

pH纸色谱（周德庆，1986）：用pH2～8的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液及pH9～10的甘氨酸－氢氧化钠缓冲液分别处理滤纸条，晾干后点样，分别在水饱和的正丁醇中展层。

以分离纯化的菌株Y23拮抗产物为上样样品，层析完成后以烟草青枯病菌为指示菌，用生物学测定法确定活性组分分布位置。

2.2.15官能团反应试验

对Y23菌株拮抗产物纯品的官能团反应试验：硫酸-蒽酮反应（李如亮，1998）、茚三酮反应（沈同等，1990）、双缩脲反应（李如亮，1998）。

3 结果与分析

3.1 抑菌活性测定

表1、表2分别为Y23菌株发酵液抑制真菌和抑制细菌的生测结果。从表1可以看出，Y23菌株发酵液在测定的15种不同供试真菌中，对禾谷镰刀菌、苹果轮纹病菌、大麦条纹病菌的抑制效果最好，菌丝生长抑制率均在55%以上；对玉米大斑病菌、甘薯黑斑病菌、玉米弯孢霉叶斑病菌的抑制效果最差，菌丝生长抑制率均在10%以下；对于所选择的其他供试真菌Y23菌株发酵液表现为一定的抑制菌丝生长的作用，其菌丝生长抑制率一般在15.0% ~ 35.0%之间，以上数据说明Y23菌株抑菌活性范围较广且对部分植物病原真菌有较好的抑制效果。从表2可以看

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出，Y23菌株发酵液在测定的3种供试细菌中，只对烟草青枯病原菌有抑菌效果，且抑菌圈直径为13mm，一般认为，抑菌圈在6~10 mm之间，为有抗药性；10 mm为轻度敏感；11~15 mm为中度敏感；16~20 mm为高度敏感（Ayakawam，1988），表2结果参照此理论可得出:Y23菌株在烟草青枯病的生物防治方面具有开发潜力。

表1 Y23菌株发酵液抑制真菌的生测结果

Table 1 Tests of fermentation products of Y23 against fungus 供试病原菌

烟草黒胫病菌 Phytophthora parasitica var. nicotianae

烟草炭疽病菌Collettrichum nicotianae 玉米大斑病菌 Exserohilum turcicum 苹果炭疽病菌 Glomerella cingulata

菌落直径（mm） Y23菌株 15.3 12.3 33.7 20.3

对照 19.7 15.3 36.0 22.7

菌丝生长抑制率（%）

29.9 29.1 7.4 13.6

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小麦赤霉病菌 Gibberella zeae 甘薯黑斑病菌Ceratocystis fimbriata 烟草赤星病菌 Alternaria alternata 禾谷镰刀菌 Fusarium graminearum 苹果轮纹病菌 Physalospora piricola 玉米弯孢霉叶斑病菌 Curvularia iunata 黄瓜炭疽病菌 Gloeosporium orbiculare 辣椒炭疽病菌 Colletotrichum capsici 小麦根腐病菌 Bipolaris sorokinana 玉米小斑病菌 Bipolaris maydis 大麦条纹病菌 Drechslera graminea

16.3 15.3 13.7 11.3 15.7 20 21.7 21.7 13.3 33.3 11.3

18.0 16.3 17.0 22.7 31.0 21.3 25 27 17.7 38.7 22.0

13.1 8.9 27.5 64.4 58.8 8.0 16.5 24.1 34.6 16.0 62.9

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