放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究 - 图文(4)

放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

病害的防治上（Casteel P等，1989），此后如放线菌酮

（Cycloheximide）、抗霉素A（Actimycin A）等一批农用抗生素被相继报道出来。这一时期的农用抗生素并未表现出对化学农药的竞争优势，研究投入少，发展缓慢。1958年，日本Setsuo等研制出杀稻瘟菌素-S（Blasticidin-S）（沈寅初，1981），并在1961年成功的大面积推广用于防治真菌病害稻瘟病，基本上取代了有机汞在当时稻瘟病防治上的应用。杀稻瘟菌素-S是世界上第一种真正意义上的农用抗生素产品，农用抗生素的研究应用从此进入了一个崭新的时期。此后，春日霉素（Kasugamycin）、多氧霉素（Polyoxins）、有效霉素（Validamycin）等众多高效低毒抗菌农药新品种相继问世，投产并推广使用。20世纪80年代发现了最有影响力的新的杀虫抗生素avermectin和除草抗生素phthoxazollin，90 年代发现了最有影响力的新的杀虫抗生素spinosad和杀菌抗生素strobilurin。其中avermectin被美国默克等公司开发成目前世界上最好的产品；phthoxazollin被作为先导化合物合成出目前最好的除草剂—草甘膦系列；spinocad和strobilurin已经成为优秀的生物杀虫剂和杀菌剂（邱德文，2007）。

现在，国外农用抗生素的研究主要集中于以下几类： 大环内酯类：日本东京研究组从近海海泥分离到的链霉菌

（Streptomycin griseus）SS－20，能产生大环内酯APlasmomycins A－C，其化学结构有1对称环，中心为硼原子，经x射线测定，其结晶属于多烯离子载体物质，能抑制革兰氏阳性细菌。

醌类：由南加利福尼亚海沉积物中分离的放线菌CNB－632，得到倍

半萜萘醌酮化合物Marinone和去溴－Marinone，具有抑菌活性。从河口一株海洋放线菌CNH－370分离获得芳香类化合物Luisols A和B，其中Luisols A为蒽醌类抗生素，属黏菌素类。OKAZAKIT等在沙漠湾浅海泥分离的钦氏菌（Chainia purpurogena），可产生SS－228Y，是一种新型的苯丙蒽醌类 （Benzanthraquinone）抗生素，具有抗革兰氏阳性菌活性。同时也是一种多巴胺—B—羟化酶抑制剂。Dijksterhuis 等(1999)报道了多粘类芽孢杆菌能产生抗生素

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氨基糖苷类：冈见吉朗从日本Tenjin岛近海海泥中分离到一株链霉菌（Streptomycin tenjimariensis），产生一种氨基糖苷类化合物天神霉素（istamycins），主要组分为Istamycin A、B，具有强烈的抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的作用，包括那些对原有的氨基糖苷类抗生素有抗性的菌种，其中组分B的抑菌活力是A的2—4倍（吴文伟等，2007）。

小环内酯类：海洋沉积物中的海洋芽孢杆菌（Bacillus sp.），产生一种新的异构香豆素 PM9128，这种碱基被取代的异构香豆素

（Isocopmarins）具有抗真菌和抗癌活性。Diane等从加利福尼亚海峡软珊瑚（Pacifigorgia sp.）表面上获得的一株链霉菌，提取到Octalactin A和B，为8员环内酯，具有抑菌活性。

蛋白及酶类：Weis发现乌贼体内共生的发光细菌（Vibrio cheri）能够产生过氧化酶，该酶具有同哺乳动物嗜中性粒细胞产生的抗菌活性的髓过氧化物酶相似的生化性质。

多肽类：佛罗里达珊瑚礁水母体附生放线菌，产生L—氨基酸形成的环肤SalinamideA和B，具有新的内酯环肽骨架，能选择性地抑制革兰氏阳性菌。Imada等从交替单胞菌（Alteromonass P.）分离得到一种低分子量多肽，称为Marinostatins，是一种广义的蛋白水解抑制剂，可抑制真菌甲壳质水解酶的活性。

杂环类:长臂虾（Palaemon nmacrodactylus）的共生海洋细菌 （Aheromonas sp.）能产生2，3—二氢吲哚二酮（2，3-indalinediane）或靛红（Istatin），对病原真菌（Logaridium callinectes）具有很强的抑制作用（张宁波，2006）。

1.13 国内农用抗生素研究进展

我国农用抗生素的研究，开始于50年代初期。我国老一辈植病学家

尹萃耘先生（1953）从陕西径阳的老苜蓿根土中分离到“5406菌株”，对棉花黄（桔）萎病有一定防治效果，揭开了我国农用抗生素研究的序幕。到60年代后期，中国科学院微生物所宋大康等先生相继筛选出灭瘟素、春雷霉素、多抗霉素产生菌，为我国农用抗生素事业作出了重大贡献。1970年国务院下发了《要积极推广微生物农药》的重要指示，进一

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步促进了我国农用抗生素的发展。1973年上海农药所筛选出井冈霉素产生菌，经多次诱变筛选出高产菌株，并在我国多家农药厂投产，每年使用面积达1亿亩以上，为我国农用抗生素的研发积累了丰富的经验。20世纪80年代上海农药研究所开发的一种杀螨抗生素，它对哺乳动物几乎无毒.是一种安全的生物农药，和有机磷及氨基甲酸酯类化合物复配能明显提高它的生物活性（朱昌雄，2000）。20世纪90年代以来，国内先后报道筛选了一些具有自主知识产权的新农抗品种，其中杀虫抗生素有戒台霉素、梅岭霉素，杀菌抗生素有宁南霉素、波拉霉素、抑霉菌素等，但目前已实用化的品种仅宁南霉素1种。我国目前杀虫、杀菌抗生素类农药29 种，120个产品，生产厂家约100个，年产制剂80 000t以上，是生产农用抗生素的大国，但具有自主知识产权实用化的有影响力的新农抗品种少。我国“九五”期间登记的宁南霉素是一种新结构抗生素，对番茄等作物病毒病和青枯等细菌病害表现出良好防效。但其发酵工艺尚需进一步完善。“八五”期间研制成功的中生菌素，对水稻白叶枯等多种细菌性病害防效显著，目前尚只有水剂和可湿性粉剂两种，还不能满足不同作物和不同生态环境应用需要。

1.14 农用抗生素的开发模型

1.14.1构建农用抗生素开发模型的必要性

新型农用抗生素的开发，一方面集中在新领域微生物资源的开发，另一方面则集中在开发模型的建立上（尹苹耘，1983）。实践证明，一种有效的农用抗生素的出现与其开发模型有关，开发模型越先进越完善，发现新抗生素的概率也越高，研制新农药的速度也就越快，因此，选择合适的抗生素开发模型，对于新型抗生素的研发具有十分重要的意义。

1.14.2 开发模型

农用抗生素作为一种生物农药，经过多年的发展，逐渐形成了自己固定化的开发模式（图1）（顾觉奋，2000）:

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图 1 抗生素筛选 Fig 1 screening of antibiotic

1.15 农用抗生素的分离纯化

1.15.1 农用抗生素的分离纯化特点

生化产品的分离和纯化具有生物学的特点，因此有其特殊的要求。例如，生物合成的发酵液（或反应液）是很复杂的多相体系。它含有微生物细胞、代谢产物、末用完的培养基等，杂质含量较高；有的还具有非常相似的化学结构及理化性能；有的具有生理活性物质，极不稳定，遇热或遇某些化学试剂极易失活或分解等。因此，从发酵液中提取、分离、纯化抗生素是一项极其复杂的工艺，主要有以下几个特点（孙彦，1998）：

⑴ 生物物质的生理活性大多是在体内的温度和条件下发挥作用的，对温度、pH值和化学试剂非常敏感,常因环境条件的变化而降低活性或失活，因此对分离纯化提出了较为苛刻的要求。

⑵ 生物产品—农用抗生素一般与人类生命息息相关，因此要求分离纯化的过程必须除去原料中含有的热源及具有免疫性的异源蛋白等对人

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体有害的物质，并防止这类物质在操作过程中从外界混入，但允许无害的少量杂质存在，要根据目标产物的使用目的，完全除去妨碍其性能发挥的杂质，但不像电子材料和无机材料要求得非常高的纯度。

⑶ 原料液中常存在可降解目标产物的杂质，如可水解目标产物的蛋白酶，因此要采用快速的分离纯化方法除去影响目标产物稳定性的杂质。

⑷ 生物大分子常存在着分子式或分子结构相同、理化性质极其相似的分子及异构体，造成了常用方法难于分离的混合物，因此要用特殊的高效分离技术纯化目标产物。

⑸ 分离纯化困难，不少生物产品，由于没有开发出技术上先进、经济上可行的提取方法或提取收率太低、成本过高而不能投产。

⑹ 原料中目标产物的浓度一般都很低，有时甚至是极其微量的，这样就有必要对原料进行高度浓缩，因此下游加工过程的成本显著增大，如酒精的浓度最高为10%，氨基酸为1%～5%，抗生素为0.1%～3%，工业酶为0.01%～0.1%，单克隆抗体为0.0001%～0.01%，而医疗用酶只有10-9左右，通常产品的成本和售价同产品的原始浓度成反比，资料表明，生物产品分离纯化费用通常占制造总成本的40%～60%。

1.15.2 农用抗生素分离纯化技术

目前的分离、纯化技术,按生产过程一般分为以下4个阶段：（1） 预处理和固液分离。（2） 提取（初步分离）。（3） 精制（高度纯化）。（4）成品制作。

1.15.2.1 预处理和固液分离

主要技术有过滤和离心,目的是去除高价无机离子和蛋白质以及发酵液中的不溶性固形物杂质和菌体细胞（沈寅初，2000）。过滤和离心相比，无论是投资费用还是运转费用都要小的多，因而首选方法应是过滤。但因发酵液中的不溶性固形物和菌体细胞均是柔性体，细胞个体很小，特别是细菌，过滤时形成的滤饼均是高度可压缩性的，所以容易造成过滤困难。离心是指利用装有固体颗粒悬浮液的容器迅速旋转产生离心加速度，使颗粒沉降的过程。离心有离心沉降和离心过滤之分，根据离心要求，选择不同的转速和离心时间，可以达到满意的离心效果。

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