放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究 - 图文(5)

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对抗生素发酵液进行预处理，一方面在于分离菌丝、除去杂质；另一方面还可以利用滤液性质的变化，尽可能使目标物转入便于操作的一相，以利于后面步骤的操作，保证成品的质量。例如用高浓度甲醇、乙醇或丙酮溶液浸提发酵液，既可以沉淀出大部分不溶性多糖和蛋白杂质又可以降低发酵液粘稠度，有利于过滤、色谱分离等进一步处理（Cohen B E等，1986）。再如采用有机溶剂乙醇∶丙酮（1∶1）的混合液可以很好的除去红树林放线菌发酵液中的的蛋白等杂质，有利于活性物质的分离纯化（廖文彬等，2004）。 1.15.2.2 提取(初步分离)

提取的目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件。提取操作中，通常是目的产物要求有较大浓缩比的过程,根据原理不同抗生素的提取方法一般分为沉淀法、溶媒萃取法、吸附法等。

沉淀法：利用了抗生素和某些酸碱形成不溶性的盐而沉淀，且此沉淀在改变条件后，可以使沉淀物重新溶解的特性。对于碱性和两性的抗生素可用不同种类的酸作为沉淀剂，酸性抗生素可和有机碱形成盐而沉淀。如红霉素可与草酸或乳酸成盐而沉淀，四环素在碱性条件下能和钙、镁等金属离子或某些季胺碱形成复合物而沉淀。对于多肽类抗生素等两性化合物，通过盐析或适当调节溶液pH值可使被分离物沉淀出来，再经过其他方法收集处理，也可起到纯化的目的。例如应用硫酸铵分级盐析法提纯枯草杆菌BS-98分泌的抗真菌蛋白，30%和70%两级饱和度，先经30%饱和度下盐析沉淀出蛋白杂质，再在70%饱和度下盐析提取活性蛋白（胡剑等，1997）。

溶媒萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同，使溶

质选择性的从一种溶剂转移到另一种溶剂中而得到纯化或浓缩的方法。所选用的溶媒对目的抗生素应有较大的溶解度和选择性，用量较少就能将其从发酵液中完全提取，两种溶媒尽量不能混溶或部分混溶，以便能形成两相分开。

尽管选择性更高、分离度更好的现代分离技术和方法不断出现，但还是不能完全替代溶媒萃取法。溶媒萃取法作为一种传统的分离技术，目前

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仍然在广泛应用于在抗生素工业生产中，螺旋霉素、林可霉素、青霉素等都采用溶媒萃取法提取（Yong M M，1985）。

吸附法：吸附法是利用吸附剂与抗生素之间的分子引力而将抗生素吸附在吸附剂上。常用的吸附剂有大孔吸附树脂、氧化铝、活性炭等。大孔吸附树脂是当前微生物天然产物分离技术领域发展最迅速、最活跃的分支之一，目前它已逐渐取代活性炭和氧化铝等吸附剂，在抗生素工业中显示出越来越重要的地位。大孔吸附树脂适合于吸附各种抗生素，它不仅可吸附脂溶性化合物，而且可以吸附水溶性化合物（Dutta M等，1999）。对于一些属于弱电解质或非离子型的抗生素，现在可考虑用大孔吸附树脂法提取（顾觉奋，1991）。 1.15.2.3 精制(高度纯化)

目的是除去与产物的物理化学性质比较接近的杂质。发酵滤液经粗提后，须进一步精制。目前抗生素精制还主要是借助色谱技术。其基本原理是由于混合物中的各个单一组分对两相不同的亲和力和向两相不均匀扩散的可能性而导致在固定相和移动相之间的不均匀分配。色谱法有不同的分类根据，按照分离机理，色谱法可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和排阻色谱；按使用频率，最常用的有薄层色谱、硅胶柱色谱、高效液相色谱等常见色谱方法。本文主要介绍常用色谱。

⑴ 薄层色谱法：它是以涂布在玻璃板等载体上的硅胶、微晶纤维素等基质为固定相，以液体展层剂为流动相的一种色谱方法，当流动相流过加有样品的固定相时，由于各组分在两相间的浓度比不同，就会以不同速度移动而分离开来。固定相的种类很多，不同性质的固定相适用范围不同，分离亲脂性化合物常选择有氧化铝、硅胶、乙酰化纤维素等；而硅藻土、纤维素、聚酰胺等则适合分离亲水性物质（Roy K等，1987）。在各类抗生素分离纯化研究中，硅胶是最常采用的固定相，90%以上的薄层色谱分离工作都可使用硅胶。李德顺，苏中锐等（2004）分离山东链霉菌产抗真菌活性物质，采用硅胶G薄板以正丁醇∶乙酸∶水（V/V/V）=3:1:1为展层剂进行操作，经生物显影，只有1个抑菌圈，其Rf值为0.487，说明该抗生素为单一组分，通过硅胶G薄板可以达到分离的目的，并为硅胶柱层析选择溶剂系统提供了参考。

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薄层色谱具有分离时间短，操作方便，比移值Rf受外界影响小，灵敏度高等优点，因此在抗生素少量样品的制备、纯化及分析鉴定等方面应用非常广泛。它是一个开放体系，所以可以直接观察被分离物质的状态，这一点其他色谱方法都不具备，进而切割色带回收样品较柱层析等方法较为方便。观察薄层色谱分离效果、定位分离目的物主要靠紫外荧光法、化学显色法以及应用生物自显影技术，其中生物自显影将薄层层析的分离功能和生物活性显现集于一体，当不同的成分经过TLC分开，同时结合抗菌筛选，快速准确的找到活性物质在薄层层析板上的位置，极大的提高了寻找目的产物的效率。

⑵ 硅胶柱色谱法：该方法的特点是进样量大，可用于用大量制备，但一次性获得样品的纯度不高，需通过多次重复使用才可得到较高纯度的样品，在实际研究中更多的是作为高效液相色谱法等精制方法的前提步骤。它是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种色谱方法。其分离过程，实质上是吸附、解吸、再吸附的连续过程。在硅胶柱色谱法中，分离效果的好坏很大层度上取决于所使用的洗脱剂，由于该法与薄层色谱在原理上具有相似性，所以在硅胶柱色谱洗脱剂的选择上通常的做法是以薄层色谱来对洗脱剂初步筛选，这样就节省了大量的时间和实验成本。但值得注意的是，由于柱色谱流动相流速快，各组分与硅胶还没达到吸附平衡就被流动相带走，降低了塔板分离效率，而且扩散作用的影响要比薄层色谱大一些，所以在实际应用中硅胶柱色谱所采用的洗脱剂的极性要比薄层色谱的展层剂小一些，并且多采用极性低一些的洗脱剂并配合梯度洗脱，以达到较好的分离效果。MotooKoitabashi等（2004）采用硅胶吸附柱，以正己烷—乙烷为流动相，体积比100:1至30:1梯度洗脱，成功的从真菌菌株Kyu-W63发酵液浓缩物中分离出两种脂溶性抗真菌组分PTF和PDF。

⑶ 高效液相色谱法（HPLC）：上世纪60年代以后，随着流动相输送和被分离物质检测技术的进步和柱色谱填料的改进，高效液相色谱技术迅速发展起来。它对样品的适用性广，不受样品的挥发性和热稳定性限制，有分离效果好、灵敏度高、分析速度快和操作方便等优点，具适

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宜于各种类型抗生素分离分析（Arai N等，2000）。目前，HPLC已成为应用最为广泛的高精度色谱技术。

按分离检测任务及特点，HPLC分为分析型HPLC和制备型HPLC来两种。分析型HPLC的色谱条件和结果是抗生素鉴定和检测的重要依据，而制备型HPLC则常被用于抗生素的最后精制。

HPLC中最常用的检测器是紫外检测器，其所能检测的物质必须具有吸收紫外光的生色团，而相应的流动相在检测波长下应当是无紫外吸收的。由于抗生素等大多数天然产物都具有一个或多个特征紫外吸收波长，因此紫外检测器能够满足大多数此类物质的检测需要。孙宇晖等（2002）采用高效液相色谱法同时分离测定聚醚类抗生素—南昌霉素和十六元大环内酷类抗生素—梅岭霉素，流动相为乙睛水溶液，其梯度洗脱程序为57％乙腈（30min）-70%乙腈（2min）-80％乙腈（2min）-90％乙腈（16min），检测波长为234nm，得到的回收率分别为98.63%和97.63%，保留时间的RSD分别为0.45和0.36。对于那些没有紫外吸收的分析样品，可通过衍生化反应对其结构进行修饰，使之具备特征紫外生色团予以解决。

HPLC流动相的选择是整个分离、分析过程能否成功的关键，通常以高极性的水与相对低极性的甲醇、乙腈等水溶性高的机溶剂搭配组成，通过调节水与有机溶剂的比例及流动相的流速来达到最分离效果。而对于无法通过上述条件的选择达到理想效果的，可以在水中加入某些弱酸或弱酸盐，通过对流动相离子强度、pH值的调节，优化HPLC分离效果。

1.15.2.4 成品制作

最后的精制成品需干燥。干燥的方法很多，如真空干燥、冷冻干燥、红外线干燥等（扶教龙等，2002）。另外，成品形式与产品的最终用途有关，有液态产品也有固态产品。

一般工艺流程和单元操作（图2，（苏蕾，2007））：

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图2 分离纯化工艺流程

Fig 2 The purification process of antibiotic

1.15.3农用抗生素分离纯化的发展趋势

目前，农用抗生素分离纯化常用的过程有沉降、离心、过滤、萃取、

吸附、离子交换、结晶等，其中沉降、离心、过滤是大多数生物加工过程所共有的操作，而液相制备色谱法分离提纯农用抗生素是最近几年发展最快的技术，该技术可有效地简化和缩短生物制品分离纯化过程，有效地提高产品纯度和加工收率，代表着现代农用抗生素分离纯化的一个发展趋势。

随着生物技术的高速发展，新的分离纯化技术不断涌现：粗分离技术中使用球磨、压力释放及冷冻加压释放等细胞破碎方法以分离胞内产物；沉淀技术采用絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的颗粒，加大沉降速率易于过滤，强化菌体分离；萃取在原有基础上，发展了多级连续萃取、双水相萃取、超临界萃取、液膜萃取、反胶团萃取等新技术；膜分离新技术发展迅速，高强度、抗污染的各种膜不断出现，其中又以超滤膜发展较快，可根据膜孔度将分子量大小不同的分子进行分离，推出了平板、板框、中空纤维和螺旋型等多种型式的成套超滤器，无机膜微滤（平均孔径一般为0.2～2μm）也已开发出成套膜组件，以管式居多，成功地用于分离微小细胞、酒类、饮料、口服液的澄清过滤，

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