放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究 - 图文(6)

放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

生化产品的错流过滤及空气除菌净化等，反渗透装置也日益增多；离子交换树脂、大孔网状离子交换树脂及大孔网状吸附树脂用于纯化蛋白质及多种活性物质等；针对生物制品的干燥技术也取得了相当的进展，如喷雾干燥、气流或流化床干燥、冷冻干燥等。此外，凝胶过滤介质、新型琼脂糖系列介质等均已实现规模生产。

1.16 农用抗生素的发展前景

目前，全世界每年新研制成功和登记注册的生物农药品种正以4%的速度递增；预计到2015年，生物农药占所有农药的份额将由现在的2%～3%增加到5%（朱昌雄，2003）。我国农用抗生素的研制目前还存在低水平重复的问题，因此，今后我国农用抗生素的研究重点主要集中在以下几个方面：

⑴ 加强农用抗生素的菌种诱变选育工作，进而丰富抗生素的品种，使产量和品质得到进一步的提高和改进。

⑵ 利用计算机信息技术将筛选出来的抗生素的几项主要数据输入后与数据库进行比对，迅速得知是否具有新的抗性或属于哪种抗生素类型，提高工作效率。

⑶ 利用发酵工程技术研究农用抗生素发酵代谢规律，旨在创制出有利于提高生产抗生素水平的发酵控制关键技术，获得大幅度提高发酵水平的新工艺，分析不同抗生素的结构和特性，选择高效安全的生物化工制剂。

⑷ 重点改造一些天然的农用抗生素以增加其用途或提高其药效。采用基因工程手段构建只能合成单一杀虫活性组分的工程菌，开发广谱、高效、安全、无残留、无副作用和无环境污染的农用抗生素。

二十一世纪是一个崭新的世纪，是生物农药在农药领域全面发展的世纪。农用抗生素作为第三代农药的主力军，正在更加广泛的领域发挥着它的作用，随着分子生物学及细胞生物学、微生物学等相关学科的发展，生物工程技术和工业发酵控制技术正逐渐变得成熟完善，这必将促进农用抗生素筛选、抗生素合成、品种改造及更新的全面发展。相信在不远的将来将会有更多的农用抗生素品种被开发用于农业生产。另外，

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对农用抗生素、病原物及植物之间相互作用机理研究得深入，必将在更深层次上使人们认识农用抗生素，使农用抗生素在更加广泛领域发挥它的作用，为全世界农业的发展做出更大的贡献。

1.17 多糖

多糖是由许多单糖分子以糖苷键结合而成的高分子碳水化合物，可用通式(CH2O)n表示。组成的单糖可以是相同的也可以是不同的。由相同的单糖组成的多糖称为均一多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。

多糖具有各种各样的生物功能，如多糖的糖链能控制细胞的分裂与分化，调节细胞的生长与衰老，能增强机体的免疫功能等。20世纪70年代，对多糖生物活性的研究领域日趋广泛，相继发现糖类物质具有抗炎、抗病毒、抗辐射、降血脂、抗水肿、抗消化性溃疡、诱导干扰素产生、促进蛋白质、核酸生物合成等功能。80年代后，发现一些天然的或人工合成的硫酸酯化多糖对艾滋病病毒有明显的抑制作用，这引起了人们极大的关注与兴趣。

随着对多糖生物活性和药理作用进一步研究，现已确证，炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增生和转换、病原体感染、植物和病原体相互作用、植物与根瘤菌共生等生理和病理过程都有糖的介导（张树正，1999）；糖类作为信息分子在受精、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面亦起着重要作用（宋绍富等，2004）。

传统的天然多糖和化学合成的高分子化合物都有其局限性，微生物发酵生产胞外多糖则克服了它们各自的缺点。微生物多糖生产周期远低于植物和海藻多糖，而且产品产量、质量和价格受季节和气候影响不大（Giavasis I等，2000；Dornish M等，1996）。与高分子化合物相比，微生物多糖可以安全地应用并容易被微生物降解，不会对环境造成污染（Li Z.J等，2000）。它是微生物在生长代谢活动中分泌到细胞壁外的多糖或多糖混合物，尤其是粘液多糖，易于与菌体分离，因而大多具有应用价值（Costerton等，1984）。微生物多糖开发中最重要的一点即发酵生产。在发酵培养过程中，培养基中无机离子的类型和浓度对微生物胞外

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多糖的合成有重要影响，尤其是金属离子，它可能参与胞外多糖合成酶系的转录与翻译的调节或激活某些酶（Vuyst等，1987；Martins L O，1990；Vuyst L D，1994）。

在生物活性研究领域中，被广泛认可的微生物多糖大都为胞内多糖及其复合物，如裂褶菌多糖（Kojima E，1986）、云芝多糖（单友亮等，1998）、香菇多糖（方积年等，1997）等；而被成功应用的微生物胞外多糖尚不多见，目前报道的仅有热凝多糖（Susanne A等，2000）、乳酸菌胞外多糖（胡东良，1997）等少数几种。

多糖的应用领域目前主要集中在医药、食品工业、石油工业等领域。在医药领域的应用研究主要集中在多糖成分的生物活性功能、药理作用与免疫保健作用。如硫酸香菇多糖等（王长云等，2000）具有抗病毒活性；能促进核酸和蛋白质的生物合成，如灵芝多糖、黄芪多糖等（王克夷等，1984；王道苑等，1984）。微生物多糖在食品工业中的应用比较广泛，可以用作食品添加剂、抗凝剂，保鲜剂等，已经获得工业应用的有结冷胶（应恺，2004；金丰秋等，2003）、黄原胶（宋国安等，1997；聂凌鸿等，2003）和热凝胶（詹晓北，2001）等。目前用于石油开采的微生物多糖主要有黄原胶等，其中黄原胶可改善注水井吸水剖面，提高注入水的利用率和油藏的注水采收率（杨建雨等，2001）。

1.18本研究的立题依据和目的意义

生物防治的基础是获得高效拮抗菌（BERGJ等，2000）。本实验室从山东临沂烟田发病烟株的原位土壤中筛选到了一株拮抗放线菌，编号Y23。前期研究表明，放线菌菌株Y23对烟草青枯病菌具有很强的拮抗作用，其发酵液对烟草植株无害且具有一定的促生效果（张薇，2009）。但对该菌产生的次生代谢物的生物活性及其分离提纯条件还知之甚少。因此探明其发酵活性成分的生物活性及分离纯化条件成为本文研究的重点。

本文从以下几个方面对放线菌Y23的抑菌活性物质开展研究： ⑴ 对Y23菌株发酵液的抑菌活性进行测定，初步判断其研究价值。

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⑵ 对抑菌活性物质的稳定性进行研究，主要从热稳定性、酸碱稳定性、紫外线稳定性等几个方面入手研究。

⑶ 分离提纯活性物质。选择适宜的分离提纯方法，得到较高纯度的抑菌活性物质。

⑷ 对抑菌活性物质的精提物进行理化性质研究，确定抑菌活性物质的离子特性，初步判断它的类别，获得该物质的部分检测特征参数，为后续的研究奠定基础。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 发酵菌株

Y23菌株是从山东临沂、日照主产烟区烟田采集病株的根围土壤中

分离纯化得到的一株放线菌（Streptomyces sp.）。

2.1.2供试病原菌

供试真菌：烟草黒胫病菌（Phytophthora parasitica var.

nicotianae）、烟草炭疽病菌（Collettrichum nicotianae ）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata）、小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）、甘薯黑斑病菌（Ceratocystis fimbriata）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata)、禾谷镰刀菌（Fusarium

graminearum）、苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）、玉米弯孢霉叶斑病菌（Curvularia iunata）、黄瓜炭疽病菌(Gloeosporium orbiculare)、

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辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokinana）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、大麦条纹病菌（Drechslera graminea），以上病原真菌均由山东农业大学农业微生物重点实验室植物病害诊断与防治研究室提供。

供试细菌： 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtills）、青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) 、软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora），以上病原细菌均由山东农业大学农业微生物重点实验室植物病害诊断与防治研究室提供。

2.1.3 培养基

固体培养基 PDA培养基（蔗糖

10g，琼脂粉10g，马铃薯200g，蒸

馏水1 000mL，pH ≈7）、高氏一号培养基（可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂粉10g，蒸馏水1 000mL，pH ≈7）。所有培养基在0.1MPa下灭菌30 min 备用。

发酵培养基 可溶性淀粉

10g，酵母浸出粉4g，K2HPO4 0.25g，蒸馏

水1000mL，pH ≈7，该发酵培养基由本实验室筛选取得。

2.1.4 试剂

蔗糖（天津市永大化学试剂开发中心）、琼脂粉（日本曹达株式会社）、可溶性淀粉（天津市凯通化学试剂有限公司）、KNO3（上海市化工厂）、NaCl（天津市凯通化学试剂有限公司）、FeSO4·7H2O（天津市凯通化学试剂有限公司）、MgSO4·7H2O（北京五七六〇一化工厂）、薄层层析用硅胶（青岛海洋化工厂）、柱层层析硅胶（青岛市基亿达硅胶试剂厂）、石油醚（天津市北方天医化学试剂厂）、乙醚（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）、苯（天津市凯通化学试剂有限公司）、氯仿（天津市凯通化学试剂有限公司）、乙酸乙酯（天津市凯通化学试剂有限公司）、分析级甲醇（天津市巴斯夫化工有限公司）、色谱级甲醇（天津市凯通化学试剂有限公司）、异丙醇（天津市凯通化学试剂有限公司）、羧甲基纤维素（CMC）北京化学试剂厂、茚三酮（上海创业中心精细化工研究所）、蒽酮（国药集团化学试剂有限公司）、正丁醇（天津市凯通化学试剂有限公司）、对甲苯磺酸（天津市英博试

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