放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究 - 图文(2)

放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

3．利用高效液相色谱对分离产品进行纯度分析，为得到最佳的效果，试验对色谱条件进行优化，结果为：色谱柱EclipseXDB_C18，5μm，4.6mm×150mm；以甲醇-水系统60∶40为流动相；流动相流速为1mL/min；柱温30℃；紫外检测波长207nm。结果表明，分离提取的活性物质纯度较高，可以满足光谱分析等进一步研究的需要。

4．拮抗产物纯品的理化性质和官能团反应。通过捷克八溶剂系统纸色谱和pH纸色谱检测，表明该活性物质是一类极性、酸性和水溶性较强的抗生素。通过官能团反应，结合紫外光谱分析，初步推断该拮抗产物纯品为一种多糖。

关键词：活性物质；分离纯化；理化性质

Abstract

Tobacco bacterial wilt caused by ［Ralatonia solanacearum(E.F.Smith) ］is a bacterial disease. It is widely occurred in Guangdong, Fujian and other southern areas of China. Recently, it has the tendency that expanded into north of China. It has happened and damaged severely in Shandong, Henan and Shaanxi province. It has become one of the major diseases on tobacco.

The strain of Y23 was isolated from the soil of the farmland being planted with tobacco in Linyi area of Shandong province of China，which has Strongly antagonistic against Ralstonia solanacearum. The purposes of this study are to identify the stability, characteristics of the antibiotics of Y23, and to isolate and purify the antibiotics，the main results are as follows：

1．Taking 15 epiphyte and 3 bacteria as object, antibiotics activity was studied. By means of mycelium growth rate, the results showed that the fermentation products of Y23

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山东农业大学硕士学位论文

had more than 55% control effects on Fusarium graminearum , Physalospora piricola , Drechslera graminea (20% of the total). By means of agar plate diffusion method, the text exhibited that the fermentation products of Y23 is just effective for refraining the growth of Ralstonia solanacearum. Though the research of stability of the fermentation products of Y23, it is indicated that Y23 had a high activity when it was stored up at 4℃, and is better stable to heat, acid, alkali and ultraviolet, but is less stable to sunlight.

2．The bioactive compounds from the culture of the strain Y23 were extracted with different solvents. The result showed that ethyl acetate was the optimal extraction for bioactive component for 3 times. After the culture was pretreated, the antibiotic substances were purified by silica gel column chromatography. The concentrated residue was passed through a silica gel column. A linear gradient elution was carried out using Petroleum ether-Isopropyl (9∶1, 7∶3, 5∶5, 2∶8). Then a antibiotic substance which has a distinct inhibition against Ralstonia solanacearum was isolated when TLC in Petroleum ether∶Isopropyl alcohol∶Methanol (10∶1∶0.5) as mobile phase.

3．The purity of this antibiotic substance was analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC) with a diode array detector using a EclipseXDB-C18 column. Analysis conditions were as follows: solvent system methanol-water(60∶40)at a flow rate of 1mL/min, with a UV detector at 207 nm. The result showed that the purity of the antibiotic substance was enough to analyze its characteristics.

4．The physico-chemical characteristics and the functional group response of the antibiotic product were studied. The partial physical and chemical properties of the antibiotic product were analyzed by Doskochilova system and paper chromatography pH. Results showed that the antibiotic product was a high polar, acerbic and hydrophilic antibiotic. The functional group response showed that the antibiotic product was a kind of polysaccharide, which was also proved by ultraviolet absorbability.

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Key words：antibiotics ; isolation and purification; character

1 引言

1.1 烟草青枯病的发生与危害

烟草青枯病1880年首次发现于美国，目前广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖的地区。在我国，该病在安徽、福建、江苏、云南、广西、河北、湖南、广东等地普遍发生（刘雅婷等，2001），个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。发病重的地块产量损失达80%左右，已成为毁灭性病害（霍沁建等，2007）。

1.2 病原与主要症状

青枯病病原菌原为茄假单胞杆菌（Pseudomonas solancearum E.F.Smith），1995 年更改为茄劳尔氏菌[Ralstonia solannacearum (E.F.Smith)]（Cardoso等，1996）。菌体杆状，两端钝圆，大小为0.9～2μm×0.5～0.8μm，具1～3 根单极生鞭毛，偶有两极生。无内生孢子，无荚膜，为好气性细菌。革兰氏染色阴性，在肉汁蛋白胨培养基上菌落为小圆形，表面润滑有光泽，初为乳白色，后变为褐色。病菌生长的温

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度范围为18～37℃，最适温度30～35℃，致死温度为52℃持续10min；pH 值4～8，最适为6.6。烟草青枯病菌在病残体中可以存活7个月，在土壤或堆肥中可存活2～3 年以上，有的竟达8～25 年，但在干燥的条件下很快就死亡，在种子表面的病菌两天后即可全部死亡。青枯病寄主范围很广，可浸染茄、豆、凤仙花等44个科的数百种植物。除烟草外，对花生、辣椒、番茄、茄子及马铃薯等为害最重，但不浸染禾本科及麻类植物（霍沁建等，2007）。

烟草青枯病是一种典型的维管束病害，最显著的症状是枯萎，危害期多出现在旺长期或旺长期后，根、茎、叶各部均可受害。发病初期，先是病侧有一、二张叶片软化萎垂，但仍为青色，故称“青枯病”。发病的中前期，烟株一直表现一侧叶片枯萎，另一侧叶片似乎生长正常，这种半边枯萎的症状可作为与其他根茎类病害的重要区别。若将茎部横切，可见发病一侧的维管束呈黄褐色至黑褐色。若纵剖病茎，则见维管束的黑色病斑为长条状，但外表仍为暗黄色。发病后期，病株全部叶片萎蔫，髓部呈蜂窝状或全部腐烂，形成中空，但多限于烟株茎基部，可与髓部全部中空的烟草空茎病相区别。若将病茎横切，用力挤压切口，可见黄白色的乳状黏液自导管处渗出，即细菌溢脓。此外，茎上的黑色条斑和叶片上的黑黄色网状病斑是烟草青枯病最重要的症状特征。

1.3 青枯病菌的致病机制

作物青枯病菌引起多种植物的致死性枯萎，主要通过根和茎的伤口或次生根的根冠进入植物体，侵染寄主的木质部，然后在整个维管束中蔓延，引起严重的萎蔫，最终导致植物死亡。青枯菌可分泌于细胞外多种细胞壁降解酶（如果胶酶类和纤维素酶类），其可能在破坏导管组织，引起植株枯萎死亡方面有重要作用；青枯菌在导管中生长时可产生大量的胞外多糖 （EPS，polysaccharide），其影响和阻碍植物体内的水分运输，特别是易于对叶柄结和小叶处较小孔径的导管穿孔板造成堵塞，因而引致植株萎蔫。

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1.3.1 青枯菌的运动性

早先人们普遍认为青枯菌的野生型没有运动性，而自发无毒突变株一般都能够运动（Kelman等，1973）。后来发现青枯菌的一些野生型也具有十分明显的运动性，而且这种运动性是重要的致病因素之一（毛国璋等，1997）。

1.3.2 青枯菌胞外蛋白

青枯菌分泌多种蛋白质到胞外， 最主要的是97kDa、80kDa、52kDa、43kDa、41kDa和28kDa的蛋白质，这些蛋白质具有一些酶的活性，例如聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶，估计这些胞外酶在细菌降解植物细胞壁的过程中发挥了重要的作用（Husain等，1958）。目前发现青枯菌产生一种葡聚糖酶，其分子量为43kDa，葡聚糖酶在致病过程中的作用与聚半乳糖醛酸酶相似，仅仅起着次要的作用（赖世龙，1998）。

1.3.3 青枯菌的胞外多糖

青枯菌的毒性菌株产生大量的胞外多糖，早在50年代人们就认为胞外多糖可能是青枯菌的致病因素，并着手研究青枯菌胞外多糖的病理学意义。上世纪80年代中期以来，已发展到从分子水平上研究这些因素的作用。佐治亚大学Denny实验室克隆出了控制胞外多糖等表型转变的基因phcA，认为这是一种综合调节基因（BrumbleySM等，1990；DennyTP等，1990）。近年进一步研究明确，这是一复合调节网络，该基因网络的成员可控制胞外多糖产生量、控制对某些环境条件或信号的反应，甚至可控制其它致病因素如纤维素酶（EG）、果胶酶（PGA）和28kDa胞外蛋白等编码基因的表达，胞外多糖是青枯病致病过程中的重要因素，其主要在引起萎蔫症状上起关键作用。

1.4烟草青枯病的发生发展规律

病菌多从烟株根部的伤口侵入，如伸根时的生理性伤口、地下害虫、土壤线虫造成的伤口均有利于病菌侵入，自下而上发展。移栽及中耕培土造成的伤口更利于病菌侵入，但是在菌量较大时，即使没有伤口

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