食品化学实验指导书(定稿)(5)

（2）对一只蛋来说分离溶菌酶已足够，层析拄的使用可以参考有关实验中的说明。 2、溶菌酶的分析

(1) 蛋白质含量的测定，可按Lowry法进行，为了分离过程中的监测方便也可采用紫外法，但因为溶菌酶中的色氨酸相对含量高且分子量小，故溶菌酶的E=26.4，

28010(010%而BSA的E=6.2，因此在用280nm测定时， 溶菌酶对标准牛血清白蛋白来说应有一个系数4。

(2) 溶菌酶活力测定：取干菌粉（M.Lysodeikticus）用0.1mol/L磷酸缓冲液配制（pH6.24），以20mg干粉/100mL为宜，此时悬浮液的光密度值应在0.5~0.7范围内.

取干酶粉用0.1mol/L磷酸缓冲液(p H6.24)配成1mg/mL。

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将酶液和底物悬液分别置于25℃水浴中保温10~15分钟，然后吸取底物悬浮液3mL置比色杯中，比色测定A450，此时为零时读数。然后加入酶液0.2mL(10μg酶)，迅速摇匀，从加入酶液起计时，每隔30秒测一次A450，共测3次（90秒）。

酶活力的定义为：每分钟A450下降0.001为一活力单位（25℃，pH6.2）。

（3）所以获得的纯化溶菌酶也可用其它方法加以验证：如等电聚焦电泳法和SDS-PAGE法。

五、结果处理

组分 F1 F2 F3 F4 总回收量 起始总量（F0） 回收率（%） 蛋白质（mg） 酶活力（单位） 回收率（%） 比活力 附：艳红K-2BP标记溶性微球菌

M.lysodeikticus的制备

1、菌体的培养与收集：取菌种Micrococcus lysodeikticus 634，接种于肉汤培养基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl0.5%、琼脂：2.5%、pH7.5压力为103.4Kpa，灭菌15分钟）。37℃培养48~72小时后收集菌体，先用蒸馏水后用丙酮反复洗涤，最后用乙醚处理，可得到干燥菌体。

2、艳红K-2BP标记溶性微球菌M.lysodeikticus：取干燥菌体5g，加入50毫升1.25mol/LNaOH，再加2.5克活性染料艳红K-2BP（上海染化入厂生产）搅拌均匀，于25℃水浴放置24小时进行染色后，3000r/min离心10分钟收集红色菌体。染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心，以尽量除去末参加反应的游离染料，必要时再用强碱性711树脂在搅拌下进行处理（树脂处理成Cl—型，pH7，树脂的湿重量约为染色菌体的50倍），除去未能洗尽的游离染料，反复处理直到上清液无色。由此得到净化的染色菌体，直接悬于0.5mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液内，制成浓度为1%底物溶液。或者将

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染色菌体冻干或制成丙酮粉，使用时再磷酸盐缓冲液配制。

六、思考题

1、从鸡蛋清中分离溶菌酶的原理是什么？ 2、影响溶菌酶分离效果的因素有哪些？

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实验九 类胡萝卜素的提取

一、实验目的

通过本实验，进一步加深对类胡萝卜素性质的理解，掌握类胡萝卜的提取方法。

二、实验原理

类胡萝卜素（carotenoids）属于四萜类天然产物，具有α、β、γ型异构体和番茄红素等，广泛分布在动物、植物和海洋生物中。类胡萝卜素是一类天然色素，近来的研究发现，β-胡萝卜素具有良好的捕获过氧自由基，阻止脂质过氧化的能力，可以防止和抵御多种疾病。番茄红素和β-胡萝卜素的结构如下：

三、实验材料、试剂和仪器

番茄酱；胡萝卜；95%乙醇；石油醚；硅胶；1%的羧甲基纤维素钠；层析柱；常规玻仪等。

四、实验内容

1、从番茄酱中提取番茄红素和β-胡萝卜素（薄层层析）

市售番茄酱含有番茄红素的红色素和胡萝卜素的黄色素。在50mL圆底烧瓶中称取3~4克番茄酱，加入10mL95%的乙醇，加热回流35min。冷却后过滤，将滤纸和滤渣移回原烧瓶中，用10mL石油醚（60~90℃）加热3min，回流、过滤，将两次滤液合并入同一锥形瓶中，加入5mL食盐水摇匀。用分液漏斗分出有机层，加入无水硫酸钠干燥。将2g硅胶、6mL1%的羧甲基纤维素钠溶液（1克CMC溶于99mL水中）拌成糊，均匀铺在三层玻璃片上晾干。经烘箱子活化后，用毛细管点样，用体积比为9：1的石油醚一丙酮作为展开剂在广口瓶中展开。测定Rf值。用紫外光谱测定薄板分离的物质，并与标准化合物谱图进行比较。

2、胡萝卜中β-胡萝卜素的提取（柱层析）

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称取3g洗净后用滤纸吸干的新鲜胡萝卜片，用剪刀剪碎并与5mL乙醇拌匀，在研钵中研磨。再依次用10mL乙醇，用5mL石油醚加热提取两次。将提取液合并到分液漏斗中，用10mL水分2次洗涤，移去水层。有机层用少量无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩溶液，剩余约0.5mL。

在长20cm内径为1cm层析柱中加入2/3高度的石油醚，用20g层析用中性氧化铝（150~160目）进行湿法装柱（见柱层析基本操作）。将胡萝卜浓缩液用滴管小心加到曾析柱顶部，加完后打开下端活塞，放出溶剂，使液面下降到柱面以上1cm左右，关闭活塞，加入数滴石油醚，重新打开活塞，重复数次，使有色物质全部进入柱体内。保持流出速度，当第一个有色物质流出时换另一个锥形瓶接收，即得橙黄色溶液。可以点板测定Rf值或进行紫外光谱分析。

五、思考题

1、薄层层析中的Rf值有什么意义？不同的展开系统对Rf值会有什么影响？ 2、番茄红素和β-胡萝卜素相比哪一个Rf值大？颜色有何不同？为什么？ 3、在提取液中加入干燥剂的目的何在？加入饱和食盐水的作用是什么？

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