新型丙型肝炎病毒Core及NS3抗原的制备(8)

方法④吸取步骤⑧中的混合液，转移至ＵＤＮＡ￥Ｉｊ备管（置于试剂盒内提供的２ｍｌ离心管）中，１２０００×ｇ离一ｔｌ，ｌｍｉｎ，弃滤液。⑤将制备管放回２ｍｌ离心管，加５００“ｌＢｕｆｆｅｒＷ１，１２０００×ｇ离，１ｌ，３０ｓ，弃滤液。⑥将制备管放回２ＩＩｌｌ离心管，加７００¨ｌＢｕｆｆｅｒＷ２，１２０００×ｇ离－０３０ｓ，弃滤液。以同样的方法再用７００ｌａｌＢｕｆｆｅｒＷ２洗涤一次，１２０００ｘｇ离心ｌｍｉｎ。⑦将制备管放回２ｍｌ离心管中，１２０００ｘｇ离一Ｉ∑，ｌｍｉｎ。⑨将制备管置于洁净的１．５ｍｌ离心管（试剂盒内提供）中，在制备膜中央加３０皿Ｅｌｕｅｎｔ（将Ｅｌｕｅｎｔ或去离子水加热至６５＂Ｃ），室温静置１ｍｉｎ。１２０００×ｇ离心ｌｍｉｎ洗脱ＤＮＡ。（２）目的片段与ｐＭＤｌ９一ＴＳｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ连接按照ｐＭＤｌ９．ＴＳｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ试剂盒说明书将凝胶回收得到的ｒＣｏｒｅ／ｒＮＳ３基因片段与ｐＭＤｌ９一ＴＳｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ连接，反应体系如下：ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ５ｐｌ去离子水１．５／．ｔｌ纯化回收ＤＮＡ３．ＪｐＭＤｌ９－ＴＳｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ０．５ｐ．１于１６℃孵育３小时。（３）重组质粒的转化①将连接产物５１ａｌ加入到感受态细胞ＤＨ５ｕ中，轻轻混匀，冰上放置２５ｍｉｎ。②４２。Ｃ水浴中热休克６０ｓ，然后迅速置于冰上２ｍｉｎ。③向管中加入０．５ｍＬＬＢ培养基（不含Ａｍｐ），混匀后３７。Ｃ、２００ｒｐｍ振荡培养４５ｍｉｎ。将上述菌液摇匀后取１００９ｌ涂布于Ａｍｐ＋的筛选平板上，正面向上放置３０ｍｉｎ，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，３７＂Ｃ温箱培养过夜。（４）摇菌培养挑取单个菌落接种于５ｍｌ含有Ａｍｐ的ＬＢ培养基，３７。Ｃ２２０ｒｐｍ振荡培养过夜。（５）质粒ＤＮＡ的提取２４硕士学位论文采用质粒小提试剂盒。试剂盒组成：ＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍ１）、平衡液ＢＬ、溶液Ｐｌ、溶液Ｐ２、溶液Ｐ３、去蛋白液ＰＤ、漂洗液ＰＷ、洗脱缓冲液ＥＢ、吸附柱ＣＰ３、收集管２ｍｌ。操作步骤：①柱平衡步骤：向吸附柱ＣＰ３中（吸附柱放入收集管中）加入５００Ｉ．ｔｌ的平衡液ＢＬ，１２０００ｒｐｍ离心１分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。②取１－５ｍｌ过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，１２０００ｒｐｍ离心１分钟，尽量吸除上清。⑨向留有菌体沉淀的离心管中加入２５％１溶液Ｐｌ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。④向离心管中加入２５０Ｉ－ｔｌ溶液Ｐ２，温和上下翻转６．８次使菌体充分裂解。⑤向离心管中加入３５０１ａｌ溶液Ｐ３，立即温和地上下翻转６．８，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。１２０００ｒｐｍ离心１０分钟，此时在离心管底部形成沉淀。⑥将上一步收集的上清液转移到吸附柱ＣＰ３中，注意尽量不要吸出沉淀，１２０００ｒｐｍ离心３０ｓ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ＣＰ３放入收集管中。⑦向吸附柱ＣＰ３中加入６００１ｘｌ漂洗液ＰＷ，１２０００ｒｐｍ离心３０—６０ｓ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ＣＰ３放入收集管中。⑧向吸附柱ＣＰ３中加入６００９ｌ漂洗液ＰＷ，１２０００ｒｐｍ离心３０—６０ｓ，倒掉收集管中的废液。⑨将吸附柱ＣＰ３放入收集管中，１２０００ｒｐｍ离心２分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。⑩将吸附柱ＣＰ３置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中问部位滴加５０．１００９ｌ洗脱缓冲液ＥＢ，室温放置２分钟，１２０００ｒｐｍ离心１分钟将质粒溶液收集到离心管中。（６）质粒双酶切鉴定将提取得到的质粒ｐＭＤｌ９－ＴＳｉｍｐｌｅ－ＣｏｒｅＤＮＡ和ｐＭＤｌ９一ＴＳｉｍｐｌｅ—ＮＳ３ＤＮＡ进行双酶切鉴定。方法＠ｐＭＤｌ９．ＴＳｉｍｐｌｅ—Ｃｏｒｅ酶切体系：ＮｏｔＩ１山ＸｂａＩ１ｌａｌ１０×ＭＢｕｆｆ；ｅｒ２ｐｌ质粒提取液４Ｌ１１灭菌水１２ｍＩ＇ｏｔａｌ２０／ａｌ３７℃孵育４小时。＠ｐＭＤｌ９一ＴＳｉｍｐｌｅ—ＮＳ３酶切体系：ＮｈｅＩ１９ｌＸｂａＩ１９ｌ１０ｘＭＢｕｆｆｅｒ２山质粒提取液４ｐｌ灭菌水１２ｐ．ＩＴｏｔａｌ２０山３７℃孵育４小时。将上述酶切产物各１０ｕ１，加入１１．ｔｌ１０×ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，混匀，取Ｍａｒｋｅｒ５ｐＩ，ＭａｒｋｅｒＤＬｌ００００５ｐｌ，注入ｌ％琼脂糖凝胶电泳鉴定，１１０Ｖ３０ｒａｉｎ。用凝胶成像系统在紫外灯下观察电泳结果并拍照。（７）测序鉴定将经双酶切鉴定正确的阳性克隆菌株送广州英俊公司进行ＤＮＡ核苷酸序列测定。利用ＤＮＡＭＡＮ软件对测序结果与模板ＤＮＡ进行比较分析。（８）菌种保存取序列鉴定正确的ｐＭＤｌ９．ＴＳｉｍｐｌｅ—Ｃｏｒｅ和ｐＭＤｌ９一ＴＳｉｍｐｌｅ－ＮＳ３菌液８０％甘油，混匀后封紧，冻存于一８０４Ｃ。（１）目的片段酶切分别取取测序鉴定正确的ｐＭＤｌ９一ＴＳｉｍｐｌｅ—Ｃｏｒｅ／ＮＳ３和空表达载体ＤＬ２０００６００１ｘｌ，加入６００９ｌ３．１．３表达质粒ｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦｌａ．Ｃｏｒｅ／ＮＳ３一ＭＣＳ—ＩＺｓＧｒｅｅｎ的构建与鉴定硕士学位论文ｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦｌｏｔ－ＭＣＳ－ＩＺｓＧｒｅｅｎ双酶切。ＱｐＭＤｌ９．ＴＳｉｍｐｌｅ—Ｃｏｒｅ和ｐＨＡＧＥ—ｆｕｌｌＥＦｌａ?ＭＣＳ－ＩＺｓＧｒｅｅｎ酶切体系：ＮｏｔＩ１９ｌｘｂａＩｌ山１０ｘＭＢｕｆｆｅｒ２ｒｔｌ质粒提取液４９ｌ灭菌水１２ｍＴｏｔａｌ２０肚ｌ３７℃孵育４小时。＠ｐＭＤｌ９－ＴＳｉｍｐｌｅ—ＮＳ３和ｐＨＡＧＥ—ｆｕｌｌＥＦｌａ－ＭＣＳ—ＩＺｓＧｒｅｅｎ酶切体系：ＮｈｅＩｌｇｌＸｂａＩｌ“ｌ１０ｘＭＢｕｆｆｅｒ２１１１质粒提取液４ｐ］灭菌水１２９ｌＴｏｔａｌ２０９ｌ３７℃孵育４小时。（２）质粒双酶切产物电泳回收将上述酶切产物各２０ｕｌ，加入２ｕｌ１０ＸＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，混匀，取ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００５ｐｌ，ＭａｒｋｅｒＤＬｌ００００５ｎｌ，换新的１×ＴＡＥ电泳缓冲液，注入１％琼脂糖凝胶电泳鉴定，１１０Ｖ３０ｒａｉｎ。用凝胶成像系统在紫外灯下观察电泳结果并切下含有目的ＤＮＡ的琼脂糖凝胶。回收步骤同３．１．２。（３）目的片段与表达载体连接和转化用Ａｘｙｇｅｎ公司的ＤＮＡ凝胶回收试剂盒对目的序列ＤＮＡ和载体片段ＤＮＡ进行回收，步骤参照３．１．２。将回收的目的序列ＤＮＡ和载体片段ＤＮＡ进行连接。连接反应体系如下：２７方法ｌ０ｘＴ４ＤＮＡｂｕｆｆｅｒ２９ｌＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ２９ｌＣｏｒｅ／ＮＳ３ＤＮＡ小片段７儿ｌｐＨＡＧＥ—ｆｕｌｌＥＦ１－ＭＣＳ—ＩＺｓＧｒｅｅｎＤＮＡ大片段６１１１Ｈ２０３／ａｌｔｏｔａｌ２０１ａｌ１６℃孵育过夜。分别将上述连接产物转化ＤＨ５ａ菌株，步骤同上。（４）摇菌培养挑取单个菌落接种于５ｍｌ含有Ａｍｐ的ＬＢ培养基，３７。Ｃ２２０ｒｐｍ振荡培养过夜。（５）阳性克隆的初步筛选将挑取的克隆菌液作为模板，做菌液ＰＣＲ，初步鉴定阳性菌液。依次加入下列组分进行ＰＣＲ扩增：去离子水１３，２ｐｌｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦｌａ．Ｃｏｒｅ／ＮＳ３．ＭＣＳ—ＩＺｓＧｒｅｅｎ菌液１ｕｌ１０ｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ２翻Ｐｒｉｍｅｒｌ：ｒＣｏｒｅ／ＮＳ３一Ｆ（１０“Ｍ）ｉⅢＰｒｉｍｅｒ２：ｒＣｏｒｅ／ＮＳ３－Ｒ（１０州）ｉ川ｄＮＴＰ（２．５ｒａＭ）Ｉ．５山ＴａｑＰＣＲＥｎｚｙｍｅ０，３ｐ１ｔｏｔａｌ２０ｐｉ混合均匀，反应条件：９５＂Ｃ预变性５ｒａｉｎ：２５个循环：９４℃变性４５ｓ，５８＂Ｃ退火４５ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ；７２℃延伸１０ｍｉｎ：４。Ｃｏ。。（６）质粒双酶切鉴定将提取得到的质粒ｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦ１ａ．Ｃｏｒｅ—ＭＣＳ．ＩＺｓＧｒｅｅｎ和ｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦｌＱ－ＮＳ３一ＭＣＳ—ＩＺｓＧｒｅｅｎ进行双酶切鉴定。①ｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦｌｑ．Ｃｏｒｅ—ＭＣＳ—ＩＺｓＧｒｅｅｎ酶切体系：

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