新型丙型肝炎病毒Core及NS3抗原的制备(4)

前言区域，存在３个高度保守结构区，后两区与病毒的进化有关，前一区毗邻病毒蛋白前体翻译的启动子ＡＵＧ，对ＨＣＶ基因组的翻译至关重要。同时５’ＵＴＲ存在内部核糖体的结合位点。核糖体可与其结合启动翻译过程。５’非编码区下游紧接一个开放阅读框（ＯＲＦ），其基因组排列顺序为５＇－Ｃ．Ｅ１．Ｅ２．ｐ７－ＮＳ２．ＮＳ３．ＮＳ４一ＮＳ５．３’，能编码一个长达３０１４个氨基酸的多聚蛋白前体，该前体经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成各自独立的病毒蛋白，即三种结构蛋白，分别为分子量２１ｋＤ的核衣壳蛋白（或称核心蛋白，ｃ），３３ｋＤ的包膜蛋白Ｅｌ，７２ｋＤ的的糖蛋白Ｅ２／ＮＳＩ，及四种非结构蛋白即ＮＳ２（２３ｋＤ）、ＮＳ３（６９ｋＤ）、ＮＳ４（３３ｋＤ）、ＮＳ５（１２４ｋＤ）。掌ｕｏ■Ｌ９ｌｏ。图２丙型肝炎病毒基因组（上）及多聚蛋白剪切（下）基本结构Ｆｉｇ２ＨＣＶｇｅｎｏｍｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ｔｏｐ）ａｎｄｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ｂｏｔｔｏｍ）１．２．３ＨＣＶ蛋白功能根据ＨＣＶ亚型的不同，其开放阅框约含有９０２４－－９１１１个碱基，编码至少１１种蛋白质，包括３种结构蛋白（Ｃｏｔｅ，Ｅｌ和Ｅ２），Ｐ７蛋白，６种非结构蛋自（ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ５Ｂ，ＮＳ５Ａ和ＮＳ５Ｂ）和…Ｆ’蛋白。ＨＣＶＣｏｒｅ蛋白是ＨＣＶ基因组中较为保守的结构区域，构成ＨＣＶ病毒的衣壳。包膜区基因包括Ｅｌ和Ｅ２两部分，分别编码相对应的两种蛋白，构成病毒的外膜１２７］。Ｅｌ和Ｅ２／ＮＳＩ糖蛋白含有中和性抗原表位，能产生抗ＨＣＶ的中和作用，能有效地诱导机体产生保护性抗体。ＮＳ２和ＮＳ４的功能还不清楚．硕士学位论文发现与细胞膜紧密结合在一起。ＮＳ３基因具有ＮＳ２．３蛋白酶活性、丝氨酸蛋酶活性、ＲＮＡ解旋酶活性和ＮＴＰ酶活性［２５】，参与解旋ＨＣＶ．ＲＮＡ分子，以协助ＲＮＡ复制。ＮＳ５有依赖于ＲＮＡ的聚合酶活性，参与ＨＣＶ基因组复制。３＇ＵＴＲ位于ＨＣＶ３’末端，由２２～５５个核苷酸组成，不编码蛋白，能稳定病毒生物学性状，对病毒复制有调节作用。Ｆｒｉｅｂｅ等研究发现３＇ＵＴＲ包括１个基因型特异的多变区（不同基因型之间具有核苷酸序列的差异）、多聚Ｕ区域（ｐｏｌｙｕ）及１段高度保守的９８个碱基的区域，称为Ｘ．ｔａｉｌ。不同基因型的ＨＣＶ的多聚Ｕ区域有不同的长度［２６］。ＨＣＶＣｏｒｅ蛋白为一种高度保守的ＲＮＡ结合蛋白，位于ＨＣＶ基因组３４２￣９１４ｎｔ区段，通过与病毒ＲＮＡ的结合来调节ＨＣＶ基因组的翻译，并且可通过直接与宿主蛋白和信号通路的相互作用来调节病毒的生命周期。体外研究显示，Ｃｏｒｅ蛋白通过与宿主蛋白的相互作用，对不同基因具有促进和抑制的作用，对原癌基因ｃ．ｍｙｃ、ＩＬ一２、劳氏肉瘤病毒（ＲＳＶ）ＬＴＲ、猿猴空泡病毒ＳＶ４０早期启动子有激活作用，并且ＨＣＶＣ蛋白可抑制肿瘤抑制基因ｐ５３启动子的活性，与肝癌的发生相关［３４】。此外，ＨＣＶＣ蛋白的表达对于ＩＦＮ—Ｑ诱导的ＳＴＡＴｌ具有显著的下调作用。ＨＣＶ感染所致的慢性肝病过程是ＨＣＶＣ蛋白对宿主肝细胞的多层面损伤及对干扰素抵抗等诸多因素作用的结果［３５】。此外，Ｃｏｒｅ蛋白氨基端富含碱性氨基酸且高度保守，其羧基端具有高度的疏水性［３６】。其抗原性较强。抗体出现较早，故抗．Ｃ抗体的检测一直是ＨＣＶ诊断的一个重要指标，目前使用的ＨＣＶ抗体检测试剂盒都含有ｃ抗原成分［３７．３９】ＮＳ３基因编码含有６３１个氨基酸的ｐ７２蛋白，位于基因组第３４２０～５３１２ｎｔ区段，分子量约为６９ｋＤ。ＮＳ３蛋白具有多种不同的生化功能，是ＨＣＶ病毒复制中重要的功能蛋白之一，发挥丝氨酸蛋白酶，解旋酶和ＮＴＰ酶活性，成为当今ＨＣＶ诊断，治疗和预防的研究热点。ＮＳ３蛋白Ｎ末端１／３具有丝氨酸蛋白酶活性，与ＮＳ４Ａ构成复合体，对多聚蛋白前体起到剪切作用。Ｃ末端２／３氨基酸构成ＨＣＶＮＳ３解旋酶（ｈｅｌｉｃａｓｅ），发挥三磷酸腺苷酶（ＡＴＰａｓｅ）和解旋酶作用，使双链ＲＮＡ解旋，对ＨＣＶＲＮＡ复制起到重要作用。此外，研究表明，ＮＳ３解前言旋酶含有大量Ｂ细胞优势表位，能在ＨＣＶ感染早期诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体。因此ＮＳ３蛋白（１１９２～１４５７ａａ）常用作ＨＣＶ抗体ＥＩＡ检测试剂盒中的包被蛋白。１．３１．３．１ＨＣＶ诊断ＨＣＶ实验室诊断血清学诊断：ＨＣＶ血清学诊断包括ＨＣＶ抗体诊断和ＨＣＶ抗原诊断。目前应用最多的是ＨＣＶ抗体检测，酲ｐ检测血清中抗ＨＣＶ抗体，主要方法包括酶免疫法（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＥＩＡ）和重组免疫印迹法（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔａｓｓａｙ，ＲＩＢＡ）。ＨＣＶ抗体酶联免疫试剂包括从第一代产品仅有ＮＳ４抗原片段发展到第三代包括核心和ＮＳ３，ＮＳ４，ＮＳ５抗原片段。研究报告显示，第三代产品的灵敏度有显著的提高，尤其是增加了ＮＳ３抗原的活性，进一步提高了血清中抗体的早期检测。由于其操作简便、不易污染、灵敏度较高，已经大规模的应用于血清筛查。目前，我国对献血者ＨＣＶ的筛查就是应用不同ＥＩＡ试剂盒产品对同一份血清样品进行检测，结果均为阳性者确定为ＨＣＶ抗体阳性。但是ＨＣＶ感染一般存在６．８周的“窗口期”，会产生对处在“窗口期”个体漏检的情况。另外，试剂盒中包被的抗原片段来自原核表达，一般为大肠菌表达，而人体内存在多种抗大肠菌的抗体，这样就会增加假阳性的发生率。有研究表明，包被抗原可用人工合成的优势抗原表位所替代，可减少非特异性反应，降低假阳性率（ＷＨＯ第６３届世界卫生大会．病毒性肝炎秘书处的报告［４０，４１】，但目前并未得到应用。ＨＣＶ抗原检测是应用抗体对血清中游离Ｃｏｒｅ蛋白的检测，可以反映血清中病毒血症的水平，并且能缩短抗体检测窗口期。在此理论基础上，建立了检测ＨＣＶｃｏｒｅ抗原的荧光酶免疫检测技术（ＦＥＩＡ）。之后，Ａｂｂｏｔ和Ｏｒｔｈｏ等公司相继推出了自己新一代的ＨＣＶＡｇ／Ａｂ检测试齐１］［４１１。可能由于ｃｏｒｅ抗原检测灵敏度的限制或其实际应用价值的缺陷，到目前为止ＨＣＶ抗原检测未能广泛应用在临床诊断。但是，在科学研究中，对于细胞或组织内ＨＣＶ抗原的检测可以作为ＨＣＶ诊断的重要证据之一。实验表明，ＨＣＶ感染者的相关组织如肝脏、脑、６硕士学位论文肾脏组织中能明显的检测出ＮＳ３蛋１刍１４２－４６】。核酸诊断：ＨＣＶ病毒学检测主要是ＨＣＶＲＮＡ的定性和定量检测。ＨＣＶＲＮＡ定性检测：主要用ＰＣＲ或转录介导的扩增术（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＴＭＡ）等扩增技术以检测血清中的ＨＣＶＨＣＶＲＮＡ定量检测：应用定量聚合酶链反应（ｑＰＣＲ）、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）、实时荧光定量ＰＣＲ等技术检测ＨＣＶＲＮＡ病毒载量。ＨＣＶＲＮＡ阳性，说明病毒在体内复制；ＨＣＶＲＮＡ阴转，说明病毒被清除。因此，ＰＣＲ可对丙型肝炎抗体检测阳性样品作进一步确诊。ＨＣＶ病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病毒疗效评估和能作为献血者ＨＣＶ筛查必检项目之一。１．３．２ＨＣＶ临床诊断感染者感染ＨＣＶ后，一般存在６．８周的窗口期。ＨＣＶ急性期大约为２．１２者伴有身体不适、全身乏力、精神不振、食欲减退、恶心、腹部疼痛等症状。之后，大约有２０％的患者其病毒可得到自发清除。若病毒持续６个月未清除者则转为慢性感染。ＨＣＶ慢性感染会引起轻微的肝脏炎症，持续的慢性炎症会导致肝纤维化，最终可能发展成肝硬化甚至肝癌，并伴有慢性肝病的一系列症状。在临床上，根据临床表现和实验室检查进行ＨＣＶ确诊。有类似症状，ＨＣＶ血清学检测阴性者，若免疫功能正常，且８周内无高危ＨＣＶ暴露，则认为无的抗一ＨＣＶ阴性者，还需检测ＨＣＶＲＮＡ以便确诊。ＨＣＶ血清学检测阳性者，如为高危人群（如吸毒者），即可确诊为ＨＣＶ感染者。如为一般人群，还需要结合ＡＬＴ和核酸检测。若都正常，则可能是ＨＣＶ抗体检测假阳性，即未感染ＨＣＶ７ＲＮＡ。ＨＣＶ预后的观察指标。另外，核酸检测还存在耗资高，容易污染等缺点，还不周。在这期间，多数患者无明显临床症状，仅伴有ＡＬＴ的轻中度升高。少数患ＨＣＶ感染，若有高危ＨＣＶ暴露，则需等３－６个月后复检。对于有免疫功能缺陷或曾经感染ＨＣＶ，但病毒己自发清除。如不正常，还要结合流行病学史（有无前言输血史、应用血制品史或明确的ＨＣＶ暴露史等）、临床表现和实验室检查的结果综合判定是否为急或慢性ＨＣＶ感染。一般认为，若患者ＨＣＶ抗体阳性，ＨＣＶＲＮＡ检测在间隔６个月后仍是阴性的，可认为患者的ＨＣＶ已清除或抗体检测假阳性。若病毒血症持续６个月仍未清除则认为是慢性感染［４７１。１．４ＨＣＶ研究模型一直以来有两个因素跟制了对ＨＣＶ的研究，一是ＨＣＶ感染的严格宿主限制性，仅感染人和黑猩猩。另一点是由于ＨＣＶ相对低的复制水平，在细胞培养时，病毒的产量非常低。由于培养模型在ＨＣＶ研究中的基础地位，建立稳定的培养模型仍是许多研究者的目标。这里面做成功的模型，是从一名患有爆发性肝炎的日本病人身上分离到一株２ａ亚型ＨＣＶ病毒株，命名为ＪＦＨ．１【４８］。并用ＪＦＨ．】株ＨＣＶ全基因ＲＮＡ体外转染Ｈｕｈ．７（ｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅ）细胞［４９，５０】或Ｈｕｈ－７分化的细胞系（如Ｈｕｈ７．５．１细胞）ｆ５１１，发现ＪＦＨ．１株能在Ｈｕｈ．７细胞中有效复制，且不产生适应性点突变，由此建立了ＨＣＶ感染性细胞模型。此系统可稳定、高效的生产具有感染性的ＨＣＶ病毒颗粒，在ＨＣＶ的研究中具有里程碑式的意义，为ＨＣＶ生活史及治病机理和药物与疫苗等方面提供研究平台。１．５慢病毒载体的结构及功能慢病毒（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ，ＬＶ）为一类逆转录病毒的总称，由慢病毒改建而来的载体系统以其高效而稳定的基因转移效率成为近来研究者们的常用选择。慢病毒载体根据其来源不同，主要分为以下几种类型：ＨＩＶ—ｌ型载体系统，ＨＩＶ一２型载体系统，猿类免疫缺陷病毒，猫免疫缺陷病毒等。其中ＨＩＶ—ｌ型载体系统研究得最为广泛和深入。在研究应用过程中，ＨＩＶ．１型慢病毒载体通过改建逐步去除了野生型病毒基因组中的致病基因，编码病毒衣壳和包膜结构的基因分别克隆于另外两个质粒中，通过三个质粒共同转染包装细胞产生完整的病毒颗粒。也就是说，Ｌｖ系统主要由三种相互辅助的质粒构成，分别是转移质粒（Ｔｒａｎｓｆｅｒｖｅｃｔｏｒ）、辅助质粒（Ｈｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄ）、包膜表达质粒（Ｅｎｖｅｌｏｐｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｉｍｉｄ）。８

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