新型丙型肝炎病毒Core及NS3抗原的制备

南方医科大学２０１１级硕士学位论文新型丙型肝炎病毒Ｃｏｒｅ及ＮＳ３抗原的制备ＮｅｗＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｅｐａｔｉｔｉｓＣＶｉｒｕｓＣｏｒｅａｎｄＮＳ３Ａｎｔｉｇｅｎｓ课题来源：国家自然科学基金（３０９７２７６５）；科技部９７３计划项目（２００９ＣＢ５２２５０７）；国家“十一．五”科技重大专项（２００９ＺＸｌ０００４．３０５）。学位中请人导专培培所师赵烁贤黎诚耀教授免疫学非定向学术型硕士研究生生物技术学院姓名称型业名养类养层在学次院答辩委员会主席答辩委员会委员江丽芳教授江振友教授付涌水教授张桂红教授张雁教授２０１４年３月１０日广州哑㈣呲瓤吣㈣吣１０她㈣硕士学位论文Ｙ２６１８５２１新型丙型肝炎病毒Ｃｏｒｅ及ＮＳ３抗原的制备硕士研究生：赵烁贤指导教师：黎诚耀摘要ＨＣＶ是一种非甲非乙型肝炎病毒，后命名为丙型肝炎病毒，归属于肝病毒属（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ），黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）。丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）感染引起的病毒性肝炎，主要通过输血、针刺、吸毒等血液途径传播。据世界卫生组织统计，目前全世界范围内，大约有１．８亿人感染了丙型肝炎病毒，仅中国就有大约４千万名ＨＣｖ感染者，感染率约为３．２％，是ＨＣＶ感染的高流行区。丙型肝炎病毒感染者中５５％～８５％发展成为慢性肝炎，其中５＂＇－－２５％进一步发展为诸如肝硬化等复合慢性肝病，并且每年又有约ｌ～４％的人发展为肝癌（ＨＣＣ），研究揭示７８％原发性肝癌由ＨＣＶ慢性感染导致。ＨＣＶ病毒基因组序列具有高度的多态性，主要可分为１１种不同的基因型，７０多种亚型。我国感染ＨＣＶ主要以１ｂ和２ａ型常见，特别是１ｂ型，约占整人群的７０％。且１ｂ型ＨＣＶ完整结构蛋白基因序列与现有基因型１ａ、ｌｂ、２ａ、２ｂ、３、４、５和６型丙型肝炎病毒之间的核苷酸序列同源性为６９．１％。ＨＣＶ病毒体呈球形，为单股正链ＲＮＡ病毒。ＨＣＶ—ＲＮＡ全长约为９．６ｋｂ，其基因组由结构（核心，囊膜）和非结构（蛋白酶，螺旋酶，酶辅助因子）蛋白及非编码区组成。位于基因中央的开放阅读框（０ＲＦ）编码３０００多氨基酸的前体多聚蛋白，其通过宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成１０个具有独立功能的ＨＣＶ蛋白，根据功能的不同分别命名为核心蛋白Ｃｏｒｅ（Ｃ），包膜蛋白１、２（Ｅｌ、Ｅ２），ｐ７和非结构蛋白ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ和ＮＳ５Ｂ。其中ＨＣＶ核心区是ＨＣＶ进行基因和血清分型的靶基因区，也是从基因水中文摘要平上治疗ＨＣＶ感染和进行疫苗研究的重要区域，而且核心区基因最为保守，其编码的抗原免疫性最强。丙型肝炎病非结构蛋白ＮＳ３（１１９２～１４５７ａａ）具有丝氨酸蛋白酶、解旋酶和ＮＴＰ酶活性，是ＨＣＶ病毒复制中重要的功能蛋白之一。ＮＳ３蛋白Ｃ末端２／３氨基酸构成ＨＣＶＮＳ３解旋酶（ｈｅｌｉｃａｓｅ），发挥三磷酸腺苷酶（ＡＴＰａｓｅ）和解旋酶作用，使双链ＲＮＡ解旋，对ＨＣＶＲＮＡ复制起到重要作用。同时，ＮＳ３解旋酶含有大量Ｂ细胞优势表位，能在ＨＣＶ感染早期诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体。Ｃｏｒｅ和ＮＳ３抗原相应的抗体出现早、分布广、亲和力强，因此Ｃｏｒｅ和ＮＳ３蛋自己成为当今血液筛查诊断试剂的主要原料。目前对丙型肝炎病毒感染者的筛查仍缺乏十分有效的快速诊断试剂。我国献血者ＨＣＶ感染筛查使用的两遍Ｅｌｉｓａ检测方法符合率仅在５０％左右，假阳性率高达３０％，对献血者队伍造成极大损害。当前检查方法使用的抗原为重组大肠杆菌表达的Ｃｏｒｅ、ＮＳ３、ＮＳ４和ＮＳ５等抗原，存在反应性写勇、非特性强等不足，严重影响了ＨＣＶ抗体检测的准确性。利用真核表达系统表达ＨＣＶ抗原，其加工修饰过程更利于氨基酸链折叠为天然构象的蛋白，具有更高的特异性。且真核表达系统表达的蛋白有更低的免疫原性，可降低原核表达系统带来的非特异性。Ｈｕｈ７．５．１细胞系来源于人肝癌细胞系，是用于体外ＨＣＶ相关研究的主要细胞系，相比于其他组织细胞更易于表达ＨＣＶ相关蛋白，且加工折叠后的蛋白更接近天然蛋白的构象与活性，可用于ＨＣＶＣｏｒｅ和ＮＳ３蛋白的大量表达。慢病毒（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ，ＬＶ）为一类逆转录病毒的亚群。由ＨＩＶ．１改建而来的慢病毒载体系统以其高效而稳定的基因转移效率而成为近年来研究者们的主要选择。由于Ｌｖ既能感染处于分裂期的细胞，又能感染处于非分裂期的细胞，而且由ＬＶ携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗力，使得目的基因可在宿主细胞内长期而稳定表达。同时，慢病毒感染目的细胞的过程与天然ＨＣＶ病毒感染细胞的过程比较相似，但慢病毒无法自我复制，具有较高的生物安全性。综上所述，与其他逆转录病毒载体相比，ＬＶ具有较高的基因转导效率，蛋白表达具有长期稳定性及较高的生物安全性。因此，以携带重组ＨＣＶＣｏｒｅ和ＮＳ３基因的慢病毒载体为表达载体，包装为重组慢病毒后感染目的细胞硕士学位论文促使其大量表达Ｃｏｒｅ及ＮＳ３抗原的方法具有重大优势与意义。我们通过从含有１ｂ型ＨＣＶＣｏｒｅ全长基因的质粒ＳＱＴ７ＤＨ．５和含有ＮＳ３全长基因的ｐＭＤ２０ＮＳ２．４Ａ质粒中分别扩增Ｃｏｒｅ和ＮＳ３目的基因，同时通过引物设计分别在Ｃｏｒｅ蛋白和ＮＳ３蛋白的Ｎ端引入分泌型亲水信号肽ＳＰ（ＭｗＴＬＶＳｗＶＡＬＴＡＧＬＶＡＧ），Ｃ端添加６Ｈｉｓ标签。即从Ｎ末端至ｃ末端为ＳＰ．Ｃｏｒｅ／ＮＳ３．６Ｈｉｓ，并将目的序列插入慢病毒载体ｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦｌＱ．ＭＣＳ—ＩＺｓＧｒｅｅｎ，构建为表达载体ｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦ１ｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦｌＱ．Ｃｏｒｅ—ＭＣＳ．ＩＺｓＧｒｅｅｎ和Ｑ—ＮＳ３．ＭＣＳ．ＩＺｓＧｒｅｅｎ。利用脂质体转染的方式将构建好的慢病毒载体与病毒包装辅助质粒ｐＭＤ２．Ｇ和ｐｓＰＡＸ２按一定比例转染２９３Ｔ细胞，通过２９３Ｔ细胞包装成具有感染活性的携带有ＨＣＶＣｏｒｅ和ＮＳ３基因的重组慢病毒ＬＶ—Ｃｏｒｅ和ＬＶ－ＮＳ３。将一定量的ＬＶ．Ｃｏｒｅ和ＬＶ－ＮＳ３感染人肝癌细胞系Ｈｕｎ７．５．１细胞，其ＲＮＡ能逆转录为ｃＤＮＡ并与目的细胞的基因组相整合，从而特异性地促进Ｈｕｈ７．５．１细胞大量表达ＨＣＶＣｏｒｅ和ＮＳ３抗原。Ｈｕｈ７．５．１细胞内表达的可溶性ＮＳ３蛋白由于带有６Ｈｉｓ的组氨酸标签，可将细胞裂解后通过Ｎｉ—ＮＴＡ和ＣＮＢｒ．４Ｂ偶联特异性抗体柱亲和层析纯化。Ｃｏｒｅ蛋白是强碱性蛋白，可通过阳离子交换的方法纯化，获得一定纯度的ＮＳ３和Ｃｏｒｅ蛋白。通过上述实验方法，用分子克隆常规方法构建并鉴定了正确的含有目的蛋白基因的表达载体ｐＨＡＧＥ．ｆｕｌｌＥＦ１Ｑ．Ｃｏｒｅ—ＭＣＳ．ＩＺｓＧｒｅｅｎ和ｐＨＡＧＥ—ｆｕｌｌＥＦ１ｄ．ＮＳ３．ＭＣＳ—ＩＺｓＧｒｅｅｎ，并通过瞬时转染２９３Ｔ的方法初步鉴定了这两个质粒能在真核细胞中正确表达目的蛋白和标签蛋白，目的蛋白存在于细胞内。通过共转染构建好的慢病毒表达质粒和第三代慢病毒包装系统的另两个辅助质粒至２９３Ｔ，分别包装得到了基因拷贝数为２．３×１０９ｅｏｐｉｅｓ／ｍｌ的ＬＶ—Ｃｏｒｅ病毒上清和基因拷贝数为３．３×１０８ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ的ＬＶ－ＮＳ３病毒上清。将一定量的重组慢病毒分别感染Ｈｕｌｌ７．５．１、ＣＨＯ和２９３Ａ细胞后通过观察绿色荧光标签蛋白和免疫荧光染色发现Ｈｕｌｌ７．５．１相比于２９３Ａ细胞更容易被重组慢病毒所感染。免疫荧光检测和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析显示，重组ＨＣＶＣｏｒｅ和ＮＳ３蛋白都主要分布于胞浆内。通过裂解细胞，将裂解上清和细胞碎片沉淀分别做ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ，发现Ｃｏｒｅ和ＮＳ３蛋白都是部中文摘要分可溶，并且ＮＳ３的亲水性要高于Ｃｏｒｅ。由于通过慢病毒整合到Ｈｕｈ７．５．１细胞中的Ｃｏｒｅ和ＮＳ３基因能持续表达，将感染了重组慢病毒并鉴定能正确表达目的蛋白的Ｈｕｈ７．５．１大量培养后收集细胞，破碎后取上清。利用ＮＳ３蛋白Ｃ端的６ｈｉｓ标签蛋白与金属离子Ｎｉ２＋的亲和性，用亲和层析的方法初步纯化从细胞中裂解出来的可溶性ＮＳ３蛋白，再用偶联了ＮＳ３特异性单克隆抗体的ＣＮＢｒ４Ｂ填料进一步纯化ＮＳ３，得到纯度约为８０％的纯化后ＮＳ３蛋白。本课题采用相近于ＨＣＶ复制的新型慢病毒介导的真核表达系统，兼具慢病毒表达载体和真核表达系统的优点，制各Ｃｏｒｅ和ＮＳ３抗原，建立大规模生产与纯化工艺，为献血者ＨＣＶ感染筛查或临床诊断提供新一代免疫测定新型抗原。关键词：丙型肝炎病毒慢病毒真核表达ＮＳ３Ｃｏｒｅ纯化应用Ｖ

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库新型丙型肝炎病毒Core及NS3抗原的制备在线全文阅读。