新型丙型肝炎病毒Core及NS3抗原的制备(7)

硕士学位论文容至１００ｍｌ。（５）ＩＦ封闭：ＰＢＳ中加ｌｇＢＳＡ（１％），加１０ｍｌ２５ｍＭＥＤＴＡ，去离子水定容至ｌＯＯｍｌ。２．５．４ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ试剂（１）５×ＳＤＳ上样缓冲液：２－ＭＥ２５０ｕｌ，１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）１．２５ｍｌ，ＳＤＳ０．５９，甘油２．５ｍｌ，溴酚蓝２５ｍｇ，加去离子水定容至５ｍｌ。（２）３０％Ａｃｒ／Ｂｉｓ母液：Ｂｉｓｏ．８９，去离子水３０ｍｌ，加去离子水于３７。Ｃ溶解完全，加入Ａｃｒ３０９，磁力搅拌器上搅拌溶解，４＂Ｃ静置过夜，加去离子水定容至１００ｍｌ，过滤后４℃避光保存。（３）１．５ＭＴｒｉｓ—ＨＣｌ（ｐＨ８．８）：ｒｉｆｆｓ９．０８９，加去离子水溶解后用ＨＣＩ调节ｐＨ至８．８，加去离子水定容至５０ｍｌ，４℃保存备用。（４）０．５ＭＴｒｉｓ—ＨＣｌ（ｐＨ６．８）：Ｔｒｉｓ３．０３９，加去离子水溶解后用ＨＣＩ调节ｐＨ至６．８，加去离子水定容至５０ｍｌ，４＂Ｃ保存备用。（ｓ）１０％ＳＤＳ：ＳＤＳ１０９，加去离子水加热至６８。Ｃ溶解后定容至ｌＯＯｍｌ。（６）１０％ＡＰＳ（过硫酸铵）：ＡＰＳｌｇ，加去离子水定容至１０ｍｌ，４＂Ｃ贮存。（７）５ｘＳＤＳ－－ＰＡＧＥ蛋白电泳缓冲液：Ｔｒｉｓ１５．１９，甘氨酸９４９，ＳＤＳ５９，加去离子水溶解后定容至１０００ｍｌ。（８）膜转移缓冲液：Ｔｒｉｓ５．８９，甘氨酸２．９９，ＳＤＳ０．３７９，加去离子水６００ｍｌ充分溶解后再加去离子水定容至８００ｍｌ，再加入甲醇２００ｍｌ，室温保存。（９）考马斯亮蓝Ｒ．２５０染色液：考马斯亮蓝Ｒ．２５００．１９，异丙醇２５ｍｌ，冰乙酸１０ｍｌ，去离子水６５ｍｌ，搅拌均匀，用滤纸除去颗粒物之后，室温保存。（１０）脱色液：乙醇４００ｍｌ，冰乙酸１００ｍｌ，加去离子水５００ｍｌ至１Ｌ。（１１）１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：Ｔｒｉｓ６．０６９，加去离子水溶解后用ＨＣｌ调节ｐＨ至７．５，加去离子水定容至５０ｍｌ，４℃保存备用。（１２）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（ＴＢＳ）：ＮａＣＩ８．８９，１Ｍ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ７．５）１０ｍｌ加入８００ｍｌ去离子水溶解后，再补充去离子水定容至ｌＬ后４℃保存。（１３）ＴＢＳＴ：ＴＢＳ中加Ｔｗｅｅｎ一２０至０．０５％。１９材料（１４）ＷＢ封闭液：５％脱脂奶粉浓度的ＴＢＳＴ，５９脱脂奶粉加入到１００ｍｌ的ＴＢＳＴ中，充分搅拌溶解，４。保存（本封闭液应现配现用）。（１５）～抗稀释液：５％脱脂奶粉浓度的ＴＢＳＴ（同ＷＢ封闭液）。（１６）二抗稀释液：ＴＢＳＴ。２．５．５ＥＬＩＳＡ试帮（１）包被缓冲液（Ｏ．０５Ｍ碳酸盐缓冲液，ｐＨ９．６）：Ｎａ２Ｃ０３１．５９９，ＮａＨＣ０３２．９３９，加８００ｍｌ去离子水溶解后，调ｐＨ值至９．６，最后定容至１０００ｍｌ。（２）磷酸盐缓冲溶液（１×ＰＢＳ液）：在８００ｍｌ蒸馏水中加入：０１２０９ＫＣｌ，８．００９ＮａＣｌ，０．２０９ＫＨ２Ｐ０４，３．１４９Ｎａ２ＨＰ０４。１２Ｈ２０或１．５６９Ｎａ２ＨＰ０４。２Ｈ２０，充分溶解，调ｐＨ值７．４，加水定容到ｌＬ，室温保存。（３）洗涤缓冲液（ＰＢＳＴ）：２Ｌ１ＸＰＢＳ，加Ｔｗｅｅｎ一２０ｌｍｌ（０．０５％＞。（４）ＥＬＩＳＡ封闭液：含４％ＢＳＡ的ＰＢＳ溶液。（５）ＥＬＩＳＡ抗体稀释液：含Ｉ％ＢＳＡ的ＰＢＳＴ溶液。（６）显色液：Ａ液：ＴＭＢ（四甲基联苯胺）２００ｍｇ，无水乙醇（或ＤＭＳＯ）１００ｍｌ，加超纯水至１０００ｍｌ，０．４５９ｍ滤膜过滤。Ｂ液：Ｎａ２ＨＰ０４?１２Ｈ２０３６．８９，Ｃ６ＨＢ０７?Ｈ２０９．３３９，Ｈ２０２０．５ｍｌ加超纯水至１０００ｒｎｌ，０．４５９ｉｎ滤膜过滤。（７）终止液（２ＭＨ２Ｓ０４）：蒸馏水１７８．３ｍｌ，逐滴加入浓硫酸（９８％）２１．７ｍｌ。２０硕士学住论文３方法３．１携带ＨＣＶＣｏｒｅ和ＮＳ３基因慢病毒载体的构建３．１．１目的基因片段制备引物设计：根据本实验室已构建质粒质粒ＳＱＴ７ＤＨ．５（１ｂ型，ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏＫＦ２８５４８３）中Ｃｏｒｅ基因序列，ｐＭＤ２０ＮＳ２．４Ａ（１ｂ型，ＧｅｎＢａｎｋＪＮ８７０２８３）中ＮＳ３基因序列，及人骨髓前体分泌颗粒信号肽序列ｓｐ，设计重组Ｃｏｒｅ和ＮＳ３蛋白引物。利用在线信号肽分析服务器ｓｉｇｎａｌＰ４．０预测骨髓前体分泌颗粒信号肽与Ｃｏｒｅ和ＮＳ３氨基酸序列融合后蛋白是否具有分泌性以及潜在的剪切位点。如图４所示信号肽序列。（ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇｒａｎｕｌｉｎｐｒｅｃｕｒｓｏｒｅＤＮＡｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ）：ＡＴＧＴＧＧＡＣＣＣｒＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＴＡＭＷＴＡＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＯ＂ＧＧＡＴＡＧＬＶＡＧＬＶＳＷＶＡＬＳｎ（Ｌ、［ｅＫｎ＼Ｓ；图４重组蛋白信号肚预测及剪切位点分析Ｆｉｇ４Ｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ扑ｄｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ用生物学软件Ｐｒｉｍｅｒ５０设计扩增引入ｓｐ序列的ｒＣｏｒｅ和ｒＮＳ３的引物，并根据目的基因的序列和ｐＨＡＧＥ．ｍＩＩＥＦＩⅡ．ＭＣＳ－ＩＺｓＧｒｅｅｎ表达载体的方法引物名称引物序列（５＇－３’）酶切位点Ｃｏｒｅ基因扩增：以质粒ＳＱＴ７ＤＨ．５为模板，扩增ｒＣｏｒｅ片段。依次加入下列组分进行ＰＣＲ扩增：去离子水ＳＱＴ７ＤＨ．５质粒ＤＮＡ１０ｘＥａｓｙ—ＡＨＦＰＣＲＥｎｚｙｍｅＢｕｆｆｅｒ１３．２９ｌ１ＬＬｌ２ｌａｌＰｒｉｍｅｒｌ：Ｐｒｉｍｅｒ２：ｒＣｏｒｅ?Ｆ（１０Ｉ．ｔＭ）ｌｐ．１ｒＣｏｒｅ－Ｒ（１０ｐＭ）１山１．５９ｌ０．３ｐ．１２０ｐｔｌｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）Ｅａｓｙ－ＡＩｔＦＰＣＲＥｎｚｙｍｅｔｏｔａｌ混合均匀，反应条件：９５。Ｃ预变性３ｒａｉｎ；２５个循环：９４６Ｃ变性４５ｓ，５８。Ｃ退火４５ｓ，７２。Ｃ延伸ｌｍｉｎ；７２。Ｃ延伸１０ｍｉｎ；４。ＣＮＳ３基因扩增：以质粒ＰＭＤ２０Ｔ－ＮＳ２—４Ａ为模板，扩增ｒＮＳ３片段。依次加入下列组分进行ＰＣＲ扩增：去离子水ｐＭＤ２０ＮＳ２?４Ａ质粒ＤＮＡ１３．２山ｌｇｌｏ。。２２硕士学位论文１０ｘＥａｓｙ—ＡＨＦＰＣＲＥｎｚｙｍｅＢｕｆｆｅｒ２ｕｌＰｒｉｍｅｒｌ：ｒＮＳ３?Ｆ（１０¨Ｍ）１１．ｔｌＰｒｉｍｅｒ２：ｒＮＳ３－Ｒ（１０９Ｍ）ｌｌｚｌｄＮＴＰ（２．５ｒａＭ）１．５１１１Ｅａｓｙ—ＡＨＦＰＣＲＥｎｚｙｍｅ０．３１ａｌｔＯｔａｌ２０Ｌｌｌ混合均匀，反应条件：９５℃预变性３ｍｉｎ；２５个循环：９４＂Ｃ变性４５ｓ，５８４Ｃ退火４５ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ；７２℃延伸１０ｒａｉｎ：４℃一。电泳检测扩增产物：取扩增产物各５山，各加入１山６×ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００，混匀，注入ｌ％琼脂糖凝胶电泳鉴定，１ＩＯＶ３０ｍｉｎ。用凝胶成像系统在紫外灯下观察电泳结果并拍照。３．１．２重组质粒ｐＭＤｌ９－ＴＳｉｍｐｌｅ－Ｃｏｒｅ／ＮＳ３的构建与鉴定（１）扩增片段回收扩增后的ＰＣＲ产物以Ａｘｙｇｅｎ公司的ＤＮＡ凝胶回收试剂盒进行回收。操作步骤如下：试剂盒内主要试剂及作用：ＢｕｆｆｅｒＤＥ．Ａ：凝胶熔化剂，含ＤＮＡ保护剂，防止ＤＮＡ在高温下降解。ＢｕｆｆｅｒＤＥ．Ｂ：结合液（促使大于７０ｂｐ的ＤＮＡ片段结合到ＤＮＡ制备膜上）。ＢｕｆｆｅｒＷ２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ：去盐液，用前按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。Ｅｌｕｅｎｔ：洗脱液（２．５ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ，ｏＨ８．５）。操作步骤：①在紫外灯下切下含有目的ＤＮＡ的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量（提前记录１．５ｍｌ离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如１００ｍｇ＝１００１ａｌ体积）。②加入３个凝胶体积的ＢｕｆｆｅｒＤＥ．Ａ，混合均匀后于６５℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于４０。Ｃ！Ｊｆｉ热），间断混合（每２．３ｍｉｎ），直至凝胶块完全熔化（约６—８ｍｉｎ）。③加０．５个ＢｕｆｆｅｒＤＥ．Ａ体积的ＢｕｆｆｅｒＤＥ．Ｂ，混合均匀；当分离的ＤＮＡ片段小于４００ｂｐ时，加入１个凝胶体积的异丙醇。力ｌｌＢｕｆｆｅｒＤＥ．Ｂ后混合物颜色变为黄色。

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库新型丙型肝炎病毒Core及NS3抗原的制备(7)在线全文阅读。