作为原料。如申报试剂用于RNA样本的检测，阳性参考品可以采用临床样本提取的RNA储备液、相应RNA冻干粉或模拟缺陷病毒（假病毒）的形式；如覆盖突变位点过多，可以对其中部分突变位点采用质粒的形式，但不能全部采用质粒，需包括部分突变类型（申请人自行确定其代表性）RNA为模板的阳性参考品以对逆转录（RT）过程进行监控。
（2） 阴性参考品
可采用经确认无相应靶突变序列的野生型DNA储存液。 （3） 检测限参考品
检测限参考品的原料要求参考阳性参考品，需包括所有的突变类型。在进行最低检测限性能评估时，应设臵多个梯度，主要从扩增反应终体系核酸浓度和突变序列所占百分率两个方面进行评价，建议采用95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。当设臵检测限参考品时，可以仅设臵一个浓度水平，该水平可略高于95%的阳性检出率水平，而设臵为100%检出，应明确参考品中靶核酸浓度水平和突变百分率。
（4） 精密度参考品
精密度参考品原料要求参考阳性参考品，需包括阴性、弱阳性、中或强阳性三个浓度水平的精密度验证，中/强阳性精密度参考品可不必包括所有突变类型，以常见突变类型（申请人自行确定其代表性）为主，但弱阳性参考品需包括
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所有突变位点。
5. 试剂盒内对照品（质控品）
试剂盒的质控体系通过设臵各种试剂盒对照品来实现，质控体系需考虑对样本核酸提取、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理的质量控制。所有阳性对照品的核酸性质应与待测样本的靶核酸性质一致，如同为DNA或RNA。对照品可采用质粒、假病毒或临床样本的核酸提取液等进行配臵。申报资料应对试剂盒对照品有关原料选择、制备、定值过程等试验资料详细说明。申请人应视申报产品具体情况设臵合理的试剂盒对照品（质控品），试剂盒质控体系主要考虑以下几方面要求。
（1） 阳性对照品（质控品）
建议对每个样品反应管设臵至少一份阳性对照品（质控品），阳性对照品应参与样本核酸的平行提取（如有必要），以对样本提取、试剂及仪器性能、扩增反应过程等环节进行质量控制，企业应对各种阳性对照（质控）品的Ct值做出明确的范围要求。如样本反应管内可以覆盖多种突变序列的检测（分型或不分型），相应的阳性对照管可以不必涉及所有突变类型，但应选择较常见突变序列或理论上较难测得的突变序列作为阳性对照。
（2） 内对照（内标）
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内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，尤其是靶核酸为RNA、用于基因重排或基因表达异常等检测目的时，可以采用管家基因或与靶基因浓度水平相当的其他基因序列作为相应的内对照（内标）。申请人应对内对照（内标）的引物、探针和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制而导致假阴性。
（3） 阴性对照
阴性对照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可以是空白对照，以对可能存在的交叉污染进行假阳性结果的质控。阴性对照品应参与样本核酸的平行提取。
由于临床标本多为经过复杂处理的病理切片或组织，其中核酸的完整性容易被破坏，从而影响后续实验结果，造成假阴性的可能性。因此，除上述对照品外，申报试剂的反应体系中应充分考虑对核酸提取环节的质量控制，比如，设臵专门的质控管对管家基因或其他源于人类基因组DNA的靶序列进行扩增，以对核酸提取的质量及效率进行评估。 (六) 主要生产工艺及反应体系的研究资料
生产工艺及反应体系的研究资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如临床样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设臵、Ct（临界）值确定等，提供确切的依据，配制
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工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率、离子浓度等关键参数进行有效控制。主要包括以下内容：
1. 主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。 2. 反应原理介绍。
3. 基因位点选择、(RT)-PCR方法学特性介绍。 4. 确定最佳(RT)-PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度等。
5. 确定逆转录过程（如涉及）的温度和时间的研究资料，PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。
6. 对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。
7. 不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。 8. 如申报产品包含核酸提取试剂，应提交对核酸提取过程进行工艺优化的研究资料。 (七) 分析性能评估资料
企业应提交在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。建议着重对以下分析性能进行研究。
若试剂用于RNA样本检测，则在性能评估中需对所有突变位点均采用RNA样本，从而对逆转录过程进行验证。
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1. 样本核酸提取
样本核酸的提取主要有以下目的：富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，样本核酸提取是决定后续核酸扩增过程成败的要素之一。尤其是石蜡包埋组织样本在福尔马林固定过程中，会使样品中的核酸与核酸之间，核酸与蛋白之间发生交联，并且样本在不当的保存条件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸提取的难度。因此，无论申报产品是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做充分的验证。除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。常见的核酸分离纯化均有其优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择核酸分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料。
2. 阳性/阴性参考品符合率
各水平、各突变位点的阳性参考品均应按要求检出阳性，考虑到浓度梯度的不同，应对各水平阳性参考品设臵相应Ct值的限制；阴性参考品在各个引物探针组合的检测条件下均应检出为阴性；如有野生型参考品的设臵，在其相应的引物探针组合下检测应为阳性。
3. 最低检测限
建议采用95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准，扩增反应终体系中的突变序列百分率和总核酸浓
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