《生物技术大实验》实验手册（试行）0906(6)

清，用70%乙醇洗涤，吹干后溶于10ul无菌水中，取1ul电泳检测。 2. 冻融法:

1) 电泳后直接切下凝胶中目的条带后加200ul TE，再加2倍体积酚，在液氮中 冻2min ，再65℃水浴中融化10min，这样重复数次.

2) 10 000g离心5 min，取上相液加2倍体积100%冰乙醇-20℃沉淀过夜。 3) 离心回收DNA，70%乙醇洗一次后溶于适量的TE或无菌水中，电泳检测回收 效果。 3 Glassmilk法:

1) 0.8%琼脂糖凝胶电泳PCR或酶切产物。 2) 紫外灯下迅速切下目的条带,放入EP管中。

3) 在含胶的EP管中加入3倍体积的凝胶裂解缓冲液混匀。 4) 6 0℃水浴5min, 以融化凝胶。

5) 加入10ul glassmilk混匀 ,室温静置5min。 6) 8 000rpm离心1min，弃上清。 7) 加入125ul漂洗液混匀。 8) 8000rpm离心数秒钟,弃上清。 9) 再加入125ul漂洗液,如此反复两次。 10) 沉淀中加入适量无菌双蒸水混匀。 11) 60℃水浴5min。

12) 1 500rpm离心2min,回收上清,取10ul电泳检测。

2.2.4. 试剂盒法(Technical bulletin of Wizard PCR Preps DNA Purification system Promaga公司): 1) 电泳分离PCR产物。

2) 用干净无菌的刀片切割目的DNA条带，放入1.5mL Ep管中，积累凝胶至大约300ul。 3) 在装有凝胶的离心管中加入1mL树脂， 65℃水浴5min或直到凝胶完全溶解。 4) 拔出注射器活塞备用，将 Syringe Barrel和Minicolumn 连接。 5) 将树脂DNA混合液移入Syringe Barrel中，插入活塞缓慢将混合液推入 Minicolumn.

6) 分开syringe Barrel和Minicolumn ,去掉活塞。重新连接Syrringe Barrel和 Minicolumn, 加入2mL 80％异丙醇到Syringe中以洗柱子。插入活塞，缓慢将

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异丙醇推入Minicolumn。

7) 去掉Syringe，将Minicolumn移入1.5mL离心管中，10 000g（半径5.5~6cm 13000rpm）离心2min以干燥树脂。

8) 将Minicolumn放入一新的离心管中，加入50ul ddH2O或TE到Minicolumn中， 放置1min，10000g，离心20sec。

9) 去除Minicolumn，将纯化的DNA贮存于4℃或-20℃。

结果分析

DNA纯化回收后, 电泳检测应为单一的条带。如果切胶过程中不慎带上杂带, 那么回收后电泳结果可能会出现两条以上的带。这时可以进行重复纯化回收。

思考题

1 纯化回收DNA的目的是什么?

2 若DNA纯化回收后的电泳结果为两条带,那么可能有哪些原因？如何补救？

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实验九 DNA体外重组

实验目的

了解DNA体外重组的基本原理，掌握基本技能

实验原理

载体与外源DNA分子体外重组时，如何选择优化连接条件以达到最高的重组率。因此有必要根据影响连接效率的因素综合考虑连接条件。影响连接效率的因素很多，如反应温度、插入片段和载体之间的摩尔比、DNA末端性质、反应时间、ATP浓度等。

1. 反应温度是比较重要的影响因素。因为连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下仅含4-6bp的退火粘末端之间的氢键结合不稳定（Tm≤15℃），不足以抵抗拒热运动的破坏，因此连接温度应介于酶的最适温度和粘末端退火温度之间，一般为4-22℃，平末端连接温度要更低些。退火粘末端之间的连接可视为分子内的连接，而平末端之间为分子间的连接。从分子动力学角度讲，后者更为复杂，且速度也要慢得多，因此平末端的连接效率要低一些为粘末端连接效率的1/10-1/100。一般采用如下组合：粘端连接反应16℃12小时或22℃4-5小时，平端连接反应4-8℃12小时。

2. 插入片段和载体之间的摩尔比经验值一般为3-10， 即插入片段要多于载体数，这样有利于提高重组率。一般的计算公式为：

载体(ng)×插入DNA长度(kb)

插入DNA分子的量（ng）= ——————————————× 比率（一般为3-10）

载体DNA长度（kb）

3.连接酶用量一般为0.1-2U,平端连接酶用量要高一些。

4.ATP浓度一般为10μΜ-1mM ,但载体环化受ATP浓度影响较大，当ATP浓度为0.1mM 环化程度最大。

5.如在反应缓冲液加一定浓度PEG可以提高连接效率。

材料，试剂和仪器

1 材料:质粒载体，插入DNA片段

2 试剂: Promega 公司的T4DNA连接酶试剂盒 3仪器：恒温水浴锅

实验步骤

1 连接

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1) 采用20ul的体系，在灭菌的200μlEppendorf管中顺序加入： 载体DNA X ul （0.5 ug） PCR产物 X ul （1.0 ug） 10×Buffer 1.0ul

T4DNA Ligase 0.5ul （1.5U） 用ddH2O补足至终体积 10ul . 2）14-16℃连接反应过夜。

结果与分析

连接成功与否，有的实验指导书上建议连接后采用电泳检测，除载体和目的DNA片段外，还应出现一条或几条电泳相对滞后的重组DNA带，表明重组成功。这在载体和目的DNA片段充足的条件下检测不失为一种直观的方法。但如果载体和目的DNA片段量较少，这种

检测就不经济了，倒不如做载体和插入片段不同比例的连接体系能获得好结果。

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实验十 重组DNA的蓝白筛选

实验目的

了解蓝白筛选的基本原理，掌握基本技能

实验原理

基因克隆的最后一道工序就是从众多的转化菌中筛选出目的阳性克隆并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，从而获得目的基因的大量拷贝，进一步研究该基因的结构、功能或表达产物。从大量的菌落或噬菌斑中鉴定出重组子有许多方法，如插入失活法、抗性筛选、蓝白筛选、杂交筛选、免疫学筛选、酶切图谱鉴定、PCR鉴定等。而蓝白筛选常用在重组子和非重组子的初步筛选中，它是通过载体和宿主菌之间基因内互补来实现。许多载体（如pUC,pBS等）都是带有包括乳糖操纵子的调控序列和编码β-半乳糖苷酶前146个氨基酸的基因序列。并在编码区中构建了多克隆位点，它不破坏读框，可使几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端，而不影响功能。若有外源基因插入多克隆位点则破坏编码读框产生没活性的α肽段。宿主菌为缺失产生α肽段的突变体，但能产生其余肽段。两者之间进行基因内互补就产生有活性的β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因在IPTG的诱导下产生肽段与宿主菌其余肽段结合成有活性的β-半乳糖苷酶 。此酶能使显色底物X-gal分解成蓝色化合物，从而使菌落发蓝。若有外源片段插入载体的多克隆位点，则使β-半乳糖苷酶基因失活，不能产生α肽，形成白色菌落。利用此方法仅通过目测就轻而一举地筛选出重组菌落。

材料，试剂和仪器

1 材料: 受体菌DH5α ，含lacZ`的重组质粒。 2 试剂:

1）LB固体培养基 2）LB液体培养基 4）0.1mol/L CaCl2 5）抗生素母液 6) 0.5mol/L IPTG 7) 100mg/mL X-gal

表2 常用抗菌素的作用方式及其抗性机理 抗菌素名称

作用方式 30

抗性机能

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