《生物技术大实验》实验手册（试行）0906

《生物技术大实验》

实验指导（试行）

四川农业大学农学院

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目录

第一章 基因克隆技术………………………………………………………3

实验一 植物基因组DNA的提取及检测 ………………………………………………3 实验二 RNA的制备和分析………………………………………………………………6 实验三 蛋白质的提取及检测……………………………………………………………9 实验四 琼脂糖电泳技术…………………………………………………………………11 实验五 PCR基因扩增及其影响因素分析………………………………………………17 实验六 核酸印迹技术-DIG标记探针的分子杂交……………………………………20 实验七 λDNAHindⅢ酶切鉴定…………………………………………………………24 实验八 DNA片段的纯化回收…………………………………………………………26 实验九 DNA体外重组…………………………………………………………………29 实验十 重组DNA的蓝白筛选…………………………………………………………31

第二章 植物基因转化技术………………………………………………35

实验一 农杆菌浸染的油菜花瓣转化表达GUS基因试验……………………………35 实验二 基因枪介导的基因转化实验……………………………………………………38 实验三 转化目的基因的检测- GUS组织化学染色……………………………………39

第三章 植物育种分子标记技术………………………………………40

实验一 RAPD分子标记技术……………………………………………………………36 实验二 SSR分子标记技术（包括垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳）………………………43 实验三 SNP分子标记技术………………………………………………………………47

第四章 重组蛋白诱导表达………………………………………………49

实验一 大肠杆菌菌种的活化和菌种的保存……………………………………………49 实验二 感受态细胞的制备-采用CaC12 法制备感受态细胞…………………………50 实验三 碱式裂解法提取表达载体质粒…………………………………………………52 实验四 大肠杆菌的热激转化法…………………………………………………………54 实验五 Taq聚合酶基因的诱导表达……………………………………………………55 实验六 Taq聚合酶的提取纯化…………………………………………………………57 实验七 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Taq聚合酶分子量及纯度………………58 实验八 Taq聚合酶活性单位标定和比活性检测………………………………………60

第五章 生物信息数据库及生物软件的使用…………………61

实验一 NCBI等数据库的使用…………………………………………………………61 实验二 常用生物软件的使用……………………………………………………………63

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第一章 基因克隆技术

实验一 植物基因组DNA的提取及检测

实验目的

通过本实验学习和掌握从植物组织中提取DNA的方法

实验原理

基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。

实验材料

玉米、马铃薯等农作物叶片

试剂配方

1. CTAB 抽提缓冲液

Table 1 CTAB Extraction Buffer (100ml)*

1 M Tris-Hcl pH 8.0

7.5 ml

NaCl 6.2g

0.5 M EDTA-8.0

3.0 ml

CTAB 2.0 g

BME 0.2 ml

* Use freshly made. Warm buffer to 60-65℃ before adding CTAB (cetyltriethylammonium bromide) and BME (β-mercaptoethanol). Add BME just prior to use under a fume hood.

2. 氯仿/异戊醇（24:1,v/v）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。

实验步骤

3

1. Sample leaves (or other organs) from vase or field. It is preferable to use young leaves

after darkness treatment of several days, although older leaves that are not senescent may be used. 2.

Place samples in a vacuum bottle with ice to keep them cool (but do not allow to freeze).

Samples may be stored at -80℃ until ready to continue the following steps. NOTE: Once sample frozen, do not allow it to thaw until continuing step 4. 3.

Remove mid rib, cut leaves into 1 cm sections, put in a mortar pre-frozen, add liquid

nitrogen, grind to a fine powder with a pre-frozen pestle and ladle in a 5 ml centrifuge tube up to about the 2 ml mark. 4.

Add 2 ml warm (65℃) CTAB extraction buffer (table 1) and mix several times by gentle

inversion. 5.

Incubate in a 65℃ water bath for 30-40 min, mixing gently by inversion every 10 min.

NOTE: Wear rubber or plastic gloves and go on with step 6-9 under a fume hood. 6.

Add one volume of chloroform / isoamyl alcohol (24:1) and mix gently by inversion for

15 min. 7.

Spin in a table-top centrifuge with 8000~10000 rpm at room temperature for 15 min.

Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube.

NOTE: Below 15℃ the CTAB and nucleic acid complex may precipitate, ruin preparation and even cause damage to the centrifuge. 8. 9.

Repeat step 6 and 7 in order to eliminate protein clearly.

Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube and add one volume of isopropanol, mix

well and keep at -20℃ for at least 10 min to separate out the DNA. 10.

Use a pin to hook out the DNA. Rinse it with ice-cold 70% ethanol twice and absolute

ethanol once. 11. 12.

Dry pellet in vacuum desiccator with middle speed for 10 min.

Dissolve the DNA in 50 μl HPLC H2O. (Add 3 μl of 10mg/ml RNase A (pre-boiled), mix

by gentle inversion and incubate at 37℃ for 30 min.) 13.

Dilute 50-500 times and read absorbance at 260 nm and 280 nm in spectrophotomemter

and calculate concentration and quality. 14.

Store at 4℃ for use or -20℃ for a long time.

注意事项

4

1. 叶片磨得越细越好 2. 移液器的使用

3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

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