《生物技术大实验》实验手册（试行）0906(3)

它的蛋白溶液可以冻存)与Zwittergent等双性离子去垢剂；③还原剂：DTT、DTE、TBP、Tris-base等；④蛋白酶抑制剂及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物(Proteaseinhibitorcocktails)等，如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子，可在其中加入0.1～5mmol/LEDTA，同时使金属蛋白酶失活。

仪器和试剂

仪器

离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱。 试剂

1.20mL样品提取缓冲液：2.5mL0.5mol/LTris-HCl 3.-20℃下预冷丙酮(含0.07%β-巯基乙醇) 4.-20℃预冷的80%丙酮(含0.07%β-巯基乙醇)

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实验四 琼脂糖电泳技术

实验目的

通过本实验学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

实验原理

在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量 大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3）电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5）区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液，混匀后再用。

天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。（1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。（2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。

琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研

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究中常用实验方法之一。

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和纯化DNA片段一种方法和技术。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分于质量相同，但构型不同的DNA分子。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。

线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系

琼脂糖凝胶的百分浓度（%）

0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

分离线状DNA分子的有效范围（kb）

60~5

20~1 10~0.8 7~0.5 6~0.4 4~0.2 3~0.1

Amount of Agarose and TBE buffer for Typical Gel Sizes and Electrophoresis Parameters Agarose concentration

Gel size Agarose 6×8cm

0.7% DNA.

for

14cm Genomic 11×

11×20cm

0.17g 0.52g 1.05g

1× TBE

Sample

Electrophoresis

mA

Time

buffer volume/well Volt 25ml 75ml 150ml 300ml 75ml 150ml

10μl 20μl 20μl 20μl 20μl 18μl

15-20 15h 15-20 15h 15-20 15h 15-20 15h 25-30 25-30

20×25cm 2.10g

14cm 1.5% for fragments 11×

1.12g

from 200 to 3500bp 12×24cm 2.25g

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such as STSs. 20×25cm 3.00g 24×24cm 4.50g 11×14cm

1.12g

200ml 300ml 75ml 150ml 200ml 300ml 75ml 150ml 120ml 200ml 300ml

20μl 16μl 20μl 18μl 20μl 16μl 20μl 18μl 12μl 20μl 16μl

100 100 100 100 100

25-30 25-30 35-40 35-40 35-40 35-40

2-3h 2-3h 2-3h 2-3h 2-3h

2% for RAPDs.

12×24cm 2.25g 20×25cm 3.00g 24×24cm 4.50g

3% for fragments 11×14cm 2.25g

below 400bp such as 12×24cm 4.50g plasimds, probe inserts 12×24cm 3.60g or SSRs (Proportion of 20×25cm 6.00g Metaphor agarose:Seakem agarose=2:1 or 1.5:1.5 for fine separation and resolution).

24×24cm 9.00g

试剂配方

1. 10×TBE, 但电泳时采用工作液位0.5 ×TBE

Table 5.2 10× TBE Gel Buffer (0.9 M Tris, 20 mM EDTA) Stock

Tris base (MW=121.10) Boric Acid (MW=61.83) 0.5 M EDTA pH 8.0

1 Liter 108.0g 55.0g 40.0ml

3 Liter 324.0g 165.0g 120.0ml

5 Liter 540.0g 275.0g 200.0ml

* pH to 8.0 with glacial acetic acid. A precipitate may form when stored for long periods of time. 2. 凝胶载样缓冲液：

0.25%溴酚蓝，40%（m/V）蔗糖水溶液, 4℃保存 protocols: 15.

Melt agarose in microwave oven, keeping covered to avoid evaporation and mixing

vigorously several times during heating. Make sure all the agarose is dissolved (it takes longer to

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dissolve than lower concentrations). The solution surface can be marked before heating and add dH2O up to the mark after heating, or weigh again after heating and make up for the evaporated weight with dH2O. Heat up one more time. 16.

Apply some vacuum to the flask containing the agarose solution to eliminate very small

bubbles created by much mixing. 17.

Cool to about 55℃ (if desired, the flask can be placed into cool water to speed cooling),

pour agarose solution right away into gel tray with taped ends and insert combs and leave it to solidify (20-30min). It could be cooled at 4℃ for 15 min before loading samples. We often prepare such gels one day ahead and keep them covered with Saran Wrap at 4℃. 18.

Remove tapes, place tray in electrophoresis rig and pour enough 0.5× TBE buffer (table

5.2) in to cover the gel by at least 0.5 cm. Remove combs only when ready to load samples. 19.

Run samples into gel according to the parameters in table 2.3 until the bromophenol blue

dye has migrated to just above the next set of wells. You may run gel at a higher rate, however resolution of the samples may suffer. Resolution can be improved by recirculating the buffer. 20.

Remove tray from rig and stain in 1μg/ml ethidium bromide (100μl of 10 mg/ml ethidium

bromide in 1000 ml dH2O) for 20 min with gentle shaking.

CAUTION: Ethidium bromide is extremely mutagenic—wear a lab gown and double gloves when handling and use extra precaution. 21.

Rinse gel in dH2O for 20 min, slide gel onto a UV transilluminator and photograph. For

Fotodyne PCM-10 camera with 20×26 cm hood and Type 667 Polaroid film use an f8 or f5.6, 1sec exposure. For Fotodyne MP-4 camera Type 665 Polaroid (negative) film use an f8 or f5.6, 2 min exposure.

注意事项

1．琼脂糖凝胶电泳时加样侧应位于负极端。 2．溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护。

3．紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。

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