规范血液及骨髓标本细菌学标准操作规程(9)

湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：粪便标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-607 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 36 页 共 62 页 9.1 空肠弯曲菌是微需氧菌，初次分离时需5%～10%CO2和85%氮。 9.2 痢疾患者要采集大量脓血标本另行培养。

9.3 粪便标本有很多杂菌，但不能由此认为粪便标本的采集就无需注意杂菌污染，为防止污染必须注意标本的采集方法。 10. 临床意义

正常情况下肠道中有多种细菌寄生，包括大量的厌氧菌、肠球菌、大肠埃希菌、肠杆菌、变形

杆菌、粪产碱杆菌等。引起感染性腹泻的病原微生物有：①细菌性：产毒素型腹泻，包括霍乱弧菌、肠毒素型大肠埃希菌等；侵袭型腹泻，包括志贺菌、肠致病型大肠埃希菌和肠侵袭型大肠埃希菌等；食物中毒，包括沙门菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蜡样芽胞杆菌和肉毒梭菌等；伪膜性肠炎，包括艰难梭菌或金黄色葡萄球菌；慢性腹泻，可能由结核杆菌引起。②真菌性：念珠菌、毛霉菌等。③病毒性：轮状病毒等。 11. 危急值报告

培养出霍乱弧菌、伤寒沙门菌、O157等及时按传染病报告，同时送CDC复核。 10. 参考文献

1 CNAS-GL23《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用指南》, 2013

2周庭银编著. 临床微生物学诊断与图解. 第二版. 上海: 上海科学技术出版社, 2007 3 叶应妩, 王毓三, 申子瑜主编.全国临床检验操作规程. 第3版 .南京: 东南大学出版社, 2006

4 Murray PR. Manual of Clinical Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 2007 5 ISO15189:2007《医学实验室-质量和能力认可准则》, 2007

操作规程：

1样本采集及注意事项：

1.1 微生物检查的粪便，由病人自然排出后，用竹签挑取脓血、粘液部分粪便，液状粪便

取絮状物送检。

1.2 粪肛拭取样：将棉签插入肛门约4－5厘米处，轻轻转动拭子，采取直肠表面粘液后取

出，插入Cary-Bliar运送培养基送检。

1.3 粪便与直肠拭子样本作微生物检查时，要特别注意携送与接种的迅速性。如有拖延，

可能会有一些非病原性的肠内细菌，生长速度超过病原菌，而使病原菌之分离发生困难。

湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：粪便标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-607 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 37 页 共 62 页 1.4 粪便含有多种杂菌，应尽量采用无菌容器。

1.5 腹泻病人应尽量在急性期采集标本（3天以内），以提高阳性率。 1.6 标本最好在用药前采集。 2标本处理与接种培养：

2.1 涂片检查：粪便标本因各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辨是否为病

原菌。因此，粪便标本一般不作直接涂片检查，只有检查霍乱弧菌以及菌群失调所致腹泻时，才作直接涂片检查。 2.1.1 检查霍乱弧菌：

染色检查：粪便通常呈米泔样。取新鲜标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色及1：10稀释的石炭酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。 2.1.2 悬滴检查：

取患者粪便，制成悬滴标本或压滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-tor型常呈穿梭状极活泼的运动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性，可初步推断为疑似O1群霍乱弧菌。 2.1.3 酵母样菌涂片检查：

在载物玻片上加1滴生理盐水，与标本混合。加盖玻片后，先用低倍镜，然后再用高倍镜观察。可发现卵圆形的芽生孢子及假菌丝，也可将涂片做革兰染色，见有革兰阳性的芽生孢子和假菌丝即报告检出酵母样菌。

2.1.4 葡萄球菌、艰难芽胞梭菌：均应做涂片革兰染色镜检，并及时报告结果。 2.2 接种培养步骤： 2.2.1 沙门-志贺菌：

接种SS、中国蓝平板，35℃、18-24h后检查平板，如未发现沙门菌或志贺菌的可疑菌落，48h重复检查一次。如仍未发现可疑菌落，可报告“未检出沙门菌(或志贺菌)”；如有疑似该两属菌种菌落，初步生化反应(双糖铁、硫化氢、动力)符合，经ATB全自动鉴定或手工鉴定，并与志贺菌诊断血清中之一发生明显凝集者，可报告“检出33志贺菌”；与沙门菌多价及群因子诊断血清凝集者，只能报告“检出3群沙门菌”；如有条件经志贺菌分型血清或沙门菌因子血清鉴定，并符合于该菌应有的抗原公式时，可报告“检出33志贺菌3型”或“检出33沙门菌”。

上述两属菌种分离时，同时做增菌培养后再分离，以提高阳性检出率。 2.2.2 霍乱弧菌培养：

取疑似患者粪便或已接种于保存液(文-腊氏保存液)的标本悬液0.5-0.1ml，接种于碱性

湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：粪便标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-607 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 38 页 共 62 页 蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。增菌培养孵育6h后，取表面菌膜移种于上述平板上，进行分离培养，并同时作涂片，行革兰染色和悬(压)滴标本，检查形态及活动力。

各种分离培养的平板在孵育18-24h后观察菌落，挑取可疑菌落，先与生理盐水混匀，观察有无自凝现象。再用O1群霍乱多价血清作玻片凝集试验，立即出现明显凝集者为阳性，有条件者再做血清分型。如具有典型菌落，运动活泼呈穿梭状，氧化酶阳性的革兰染色阴性弧菌。在霍乱流行期间，可判定为O1群霍乱弧菌。在霍乱流行期间，根据上述结果并结合临床即可对病人作出霍乱病的诊断。并立即向当地防疫部门提供准确、及时的信息。

2.2.3 致病大肠埃希菌培养：

引起腹泻的大肠埃希菌常见有4种类型，即产肠毒素大肠埃菌(ETEC)、致病性大肠埃希菌(EPEC)、侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和出血性大肠埃希菌(EHEC)。取液体状、脓血或糊状粪便或肛拭子划线接种于中国蓝血琼脂平板上，35℃孵育18-24h，挑选乳糖发酵菌落5个，移种于KIA和MIU孵育过夜后，根据生化反应作鉴定并进行血清学分型，分型方法参阅有关资料。 2.2.4 副溶血弧菌培养：

取粪便（或可疑食物）接种于副溶血弧菌增菌液中，同时划线分离于副溶血弧菌选择性平板和SS琼脂平板上，35℃孵育18-24h后，观察菌落。增菌管在孵育6-8h后移种至上述平板，同样孵育18-24h。生长在副溶血弧菌选择培养基上的菌落特性是：直径可达1-2.5mm，微隆起，混浊，无粘性，绿色，湿润，菌落中心绿色较深；在SS琼脂上的菌落直径为1-2mm，扁平，中间隆起宛如蜡滴，无色透明，菌落粘稠，往往不易挑起。能被挑起者呈粘丝状，稍久则粘固于培养基面上，不能刮离，并有辛辣气味。挑选菌落移种于含盐的KIA、MIU及作无盐、高盐试验，进行鉴定。 2.2.5 小肠结肠炎耶尔森菌培养：

从粪便中分离小肠炎耶尔森菌常与其他肠道致病菌同时检查，将标本划线接种于新耶尔森菌选择培养基(NYE)及中国蓝琼脂平板上，分别作22-25℃、35℃孵育。前者用于分离小肠结肠炎耶尔森菌，后者用于沙门菌和志贺菌属的分离。带菌者的粪便和肛拭子可在pH7.4-7.8的PBS中，经4℃增菌21天，然后于第7、14天及21天，各取0.1ml移种于选择培养基上。各平板经孵育48h后，小肠结肠炎耶尔森菌在NYE及中国蓝平板上呈乳糖不发酵菌落，透明或半透明，较小，扁平，无色，稍隆起，在SS平板上生长较差，将疑似菌落移种于KIA、MIU上及其他生化反应培养基作鉴定。 2.2.6 空肠弯曲培养：

湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：粪便标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-607 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 39 页 共 62 页 取液状或带血粪便或在卡-步(Cary-Blair)氏运送培养基中的标本立即接种于弯曲菌选择培养基(Camp-BAP血琼脂、Skirrow血琼脂或Butzler血琼脂)，或接种于CEM增菌液（经43℃微需氧培养18-48h后，再移种于上列选择培养基上作划线分离），在43℃微需氧（可用烛缸法）条件下孵育。最好采用混合气（85％N、10％CO2、5％O2）的方法，孵育种24-48h后，观察生长情况及菌落。弯曲菌形成直径1-2mm、凸起、略带红色、有光泽的半透明的菌落。培养基表面如不太干燥，空肠弯曲菌和大肠弯曲菌可扩散生长，形成扁平的大菌落。各型菌落均不溶血，取此类菌落作悬滴或压滴观察动力，可见呈摆动的投标样动力，革兰染色为阴性、细长、两端稍尖的弧形杆菌，亦有呈S形、螺旋形成幼锤形者。弯曲菌的鉴定必须结合多种试验加以确定。 2.2.7 葡萄球菌培养：

取绿色、海水样或糊状粪便划线，接种于甘露醇食盐琼脂平板上，35℃孵育过夜，观察菌落。挑取甘露醇食盐平板上的黄色菌落，涂片，行革兰染色，镜检。如查见为革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，则作凝固酶、DNA酶及甘露醇发酵（金黄色葡萄球菌和腐生葡萄球菌能厌氧分解甘露醇，而表皮葡萄球菌则否）等试验加以鉴定，同时接种杜尔曼(Dolman)培养基，孵育于35℃，3％-5％CO2环境中，以备作肠毒素测定 2.2.8 真菌培养：

真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后，常见于白色念球菌、球拟酵母菌。将标本接种于含氯霉素的沙氏琼脂及血琼脂平板上，置25-30℃和35℃孵育24-48h，根据菌落形态及涂片革兰染色所见结果，决定鉴定方法。 2.2.9 菌群失调及菌交替症：

患有菌群失调及交替症患者，为正常菌群的比例失调，因此，根据临床提示粪便培养需选用数种培养基，包括强选择和弱选择性肠道菌培养基、需氧及厌氧血琼脂平板、甘露醇食盐琼脂平板、Camp-BAP血琼脂平板、沙氏琼脂等。将22℃、35℃、42℃，需氧、微氧及厌氧环境中，生长后按各类细菌分别进行鉴定，并观察其数量变化。报告方式为“检出33菌”及其数量。 3报告方式：

报告方式应以分离目的菌种的结果而决定，如：目前常规以SS和中国蓝分离粪便中的致病菌，阳性者应报告“沙门菌或志贺菌”。阴性应报“未检出沙门菌属和志贺菌”。其他培养结果报告方式，与上述原则基本相同。 4粪便标本病原菌

粪便标本中常见的病原菌

革兰阳性菌

革兰阴性菌

湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：粪便标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-607 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 40 页 共 62 页 金黄色葡萄球菌 厌氧链球菌 结核分枝杆菌 产气荚膜梭菌 艰难芽孢梭菌 白色念珠菌

5粪便标本操作流程：

伤寒及沙门菌属 志贺氏菌属 致病性大肠埃希菌

（ETEC、EPEC、EIEC、EHEC） 弧菌属菌种 气单胞菌种 邻单胞菌 小肠结肠耶尔森菌 弯曲菌

粪便或肛拭子

分离培养

中国蓝 亚栖酸盐增菌培养基 GN增菌培养基 TCBS SS琼脂平板 （适于沙门菌属） （适于志贺菌属） (适于弧菌)

SS及中国蓝琼脂平板分离

三糖或双糖铁培养基

血清学鉴定 生化反应鉴定 药物敏感性试验

报 告 附：

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