规范血液及骨髓标本细菌学标准操作规程

湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 修改号：0 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-601 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 发行部门：质量管理小组 审核人：肖平 页码：第 1 页 共 62 页 1. 目的

规范血液及骨髓标本细菌学标准操作规程，确保检验结果准确可靠。 2. 适用范围

血液及骨髓。 3. 标本

3.1 标本类型 血液及骨髓。 3.2 标本采集

3.2.1 采血时间 抗菌药物治疗前，发热初期或高峰时抽血。

3.2.2 采血频率 对怀疑菌血症的成人患者，推荐同时在不同部位采集2~3套（每套包括

一瓶需氧瓶，一瓶厌氧瓶或者两套需氧瓶）对感染性心内膜炎和真菌血症则应多次采集；婴幼儿患者，推荐同时在不同部位采集2套，可不做厌氧培养。

3.2.3 采血量 以无菌方法从患者肘静脉或股动脉采血。采血量以培养基的1/10为宜，成

人一次采血10-20ml，儿童为3-5ml。血液抽出后，立即以无菌操作注入血培养瓶，充分混合后送检。

3.2.4 骨髓标本 用骨髓穿刺针从髂骨采集1-2ml,立即以无菌操作注入血培养瓶，由于骨髓

标本量少可选择小儿需氧瓶及厌氧瓶。 3.3 标本拒收标准

3.3.1 血培养瓶破裂或有明显污染。 3.3.2 培养瓶标识与化验申请单不符。

3.3.3 用过期的培养瓶采集标本，采血量不足等。

3.3.4 对于不合格标本，应及时通知采集人员重新留取标本。 3.4 标本保存

采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置室温，切勿放冰箱。冬季血培养瓶在送检过程应采取一定的保暖措施。 4. 试剂、仪器

4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板、沙保罗平

板相关生化试剂等。

4.2 BACT 9050全自动血培养系统、ATB Expression鉴定及药敏分析仪。成人需氧血培养

瓶，厌氧血培养瓶、儿童血培养瓶、TDR系统鉴定卡及药敏板。

4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2 培养、生物安全柜等。 4.4 试剂的有效期和使用参照试剂说明书。 5. 细菌鉴定和药敏质控

参见《微生物组室内质量的控制程序》。

湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 修改号：0 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-601 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 发行部门：质量管理小组 审核人：肖平 页码：第 2 页 共 62 页 6. 检验步骤

接收标本后，立即用Lis系统签收对标本进行编号、登记。门诊病人要同时登记联系电话等病人信息。 6.1 自动化培养

6.1.1 置全自动血培养仪中。当标本有菌生长时，仪器发出阳性报警，应立即用无菌注射器

抽取瓶内培养液作直接涂片革兰染色，镜检，将结果向临床医生报告，同时转种血琼脂平板，中国蓝平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35℃、5% CO2 培养箱培养18~24h。若涂片为酵母样真菌时，转种到念珠菌培养基上。从琼脂平板上挑取菌落进行涂片染色及触酶和氧化酶试验。革兰阳性菌和革兰阴性菌分别选用相应卡片上机进行细菌鉴定和药敏试验或者做K-B法药敏试验（具体操作见《药物敏感性试验标准操作规程》）。

6.1.2仪器培养为阴性，报阴性后卸下血培养瓶，可报阴性结果。 6.2 手工培养

6.2.1 将血培养瓶置35℃孵育箱，经18~20 h孵育在血琼脂平板或巧克力平板上盲目转种

一次。

6.2.2 盲目传种后，培养瓶继续孵育至第5日，每日观察一次有无菌生长，并摇匀继续培养，

下列几种情况提示有细菌生长。见下表1。

表1 培养瓶中有细菌生长时的不同反应

反应 菌种

浑浊并有凝块 均匀浑浊，发酵葡萄糖产气 微浑浊，有绿色变化

表面有菌膜，培养液清晰，底层溶血 表面有菌膜，膜下呈绿色浑浊

血细胞层上面出现颗粒状生长，有自上而下的溶血 厌氧培养瓶有变化，而需氧培养瓶无细菌生长

金黄色葡萄球菌 大多为革兰阴性菌 肺炎链球菌 枯草杆菌 铜绿假单胞菌 溶血性链球菌 可能为厌氧菌

根据肉眼观察，对有细菌生长迹象，取菌悬液涂片作革兰染色，同时分离培养，接种需氧血琼脂平板，中国蓝平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35℃、5%CO2 培养箱培养18～24h。次日纯培养再进行鉴定及药敏试验。 7. 操作流程

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8. 结果报告

8.1 阳性结果报告 报告通常分为三级：

一级报告 细菌种类 需氧培养 血液、骨髓 置血培养仪瓶中 厌氧培养 血培养仪报警，挑取培养物 涂片、染色 转种平板35℃ 培养18～24 h 直接药敏 二级报告 观察菌落特征 及涂片、染色 仪器或手工细菌 鉴定及药敏试验 三级报告（最终报告） 8.1.1一级报告 阳性报警血培养瓶应进行涂片革兰染色，将涂片结果电话（或其他方式）通

知临床，同时记录报告的日期、时间、内容以及接收报告人的姓名和工号。血培养阳性应列为危急值。

8.1.2 二级报告 报告直接药敏试验结果。

直接药敏试验，将血培养阳性标本进行革兰染色，如涂片找到细菌，根据革兰染色结果选择药敏所用培养基（Muller-Hinton或含5%羊血Muller-Hinton琼脂平板），取阳性血培养标本约0.2ml，用无菌棉签均匀涂布于琼脂表面，根据革兰染色结果选择所用抗菌药物的纸片，如镜检见革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科常用的抗菌药物纸片；若为革兰阳性球菌，成对排列，选

湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 修改号：0 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-601 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 发行部门：质量管理小组 审核人：肖平 页码：第 4 页 共 62 页 择葡萄球菌用的抗菌药物纸片。然后置35℃，孵育18~24h读取初步药敏结果。纯培养再进行菌株鉴定和药敏试验，发最终报告。

注：最终结果如与初步报告不符，应及时与临床沟通，并在书面最终报告注明变更内容。 8.1.3 三级报告 报告细菌种属、药敏试验、结果评价和建议。

8.2 阴性结果报告 血培养72h未见细菌生长，应通知临床医师，以便作相应处理，但培养瓶

要继续培养至第5日，方可发出阴性报告。如果发现有菌生长，可补发报告。 8.3 对发出报告进行销号，并作好菌名或无菌及报告日期登记。 8.4 传染病（伤害沙门菌）报医务部\\或防保科。 8.5 传染病菌种保存(伤寒沙门菌)交疾病控制中心复核。 9. 注意事项

9.1 抽血后无需更换针头即可注入血瓶中。 9.2 抽血前即应贴好标签，标签不能贴到条形码。

9.3 若不能立即送至实验室，应置于35℃温箱或室温，绝不可放置冰箱。 9.4 有自动血培养仪的实验室，应及时处理阳性报警标本。

9.5 如不同部位采集的两瓶血培养瓶出现一瓶阳性一瓶阴性，或者出现两瓶均为阳性，检测结果均为凝固酶阴性葡萄球菌， 这两种情况都应该向临床报告和沟通。 10. 临床意义

引起败血症的多为耐药性金黄色葡萄球菌、某些革兰阴性杆菌及部分球菌。疖、痈、脓肿和化脓性骨髓炎继发的败血症主要由金黄色葡萄球菌和β溶血链球菌引起，尿道、胆道、胃肠道炎症和黏膜损伤引起的败血症以大肠埃希菌最常见，烧伤后铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌多见。伤寒和副伤寒于病程第1～2w做血液细菌培养，伤寒和副伤寒沙门菌的检出率可达80%～90%。 11. 危急值报告

仪器报警阳性标本直接涂片、革兰染色，确定细菌种类，应立即向临床报告细菌涂片结

果。

参考文献

1 CNAS-GL23《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用指南》, 2013 2周庭银编著. 临床微生物学诊断与图解. 第二版. 上海: 上海科学技术出版社, 2007 3 叶应妩, 王毓三, 申子瑜主编.全国临床检验操作规程. 第3版 .南京: 东南大学出版社。 4 Murray PR. Manual of Clinical Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 2007 5 徐英春, 倪语星, 王金良, 等主编. 血培养操作规范. 上海: 上海科学技术出版社, 2002

湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 修改号：0 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-601 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 发行部门：质量管理小组 审核人：肖平 页码：第 5 页 共 62 页 血液操作规程

1．概述

血液是临床微生物室所接收培养的重要标本，在大多数病人血液中出现细菌为菌血症。原发性菌血症来自机体部位污染细菌，如粘膜的细菌入血，可能经历亚临床结果，继而出现临床的菌血症。败血症包含菌血症，意指带有临床迹象和症状，如发热、寒战和心动过速。败血症休克提示败血症伴有血压过低，严重败血症是以败血症休克伴有器官或全身衰竭特点，20%-40%死亡率。继发性菌血症，如肺炎原始部位的感染播散菌血症。 2．标本采集

2.1 一般情况下，在病人发热高峰时，采集血液标本。对持续性菌血症可不考虑采血时间，

而某些间歇性菌血症，应在病人体温上升期采血。采血时间原则上应选择在抗菌药物应用前，对已用药而不能中止用药的病人，应在下次用药前采集。用药前24小时内采集3－4次血液标本，可使细菌检出率高达90％。

2.2一般在肘静脉采集血液，其次是股动脉。采血部位的局部皮肤应彻底消毒，通常用碘酒

涂布消毒，干后用75％酒精擦拭，消毒时应以穿刺部位为中心逐渐向外延伸消毒。 2.3系上止血带，抽取5-10ml血液，若为婴儿或小孩则只抽取2-5ml血液。 2.4将液注入BD血培养瓶，婴儿或小孩则用小儿专用BD血培养瓶。

2.5疑似分枝杆菌感染或霉菌感染之病人则抽取血液10ml，注入血液于专用结核培养瓶或

真菌培养瓶。 3．标本处理及注意事项

3.1 每一发烧病人抽血次数以每次抽二瓶为原则，同时左右肘臂各抽一瓶。如果病患情况

危急，同时亦可采集身体不同部位血液做两套培养。但是不可由血管导管抽取血液样本。

3.2 抽取血液后，不需要更换针头即可注入血瓶中，以避免针扎后污染率提高。

3.3 抽血前，血瓶应先将病患标签贴好，病患标签不可贴在血液培养瓶的条码上及玻璃上。 3.4 注入标本的血培养瓶务必立即送至微生物室。如因某种原因不能立即送检时，应放置

室温，切勿存放冰箱。微生物室收到血培养瓶后应立即登记后放入培养箱。

3.5 两种以上细菌或细菌和真菌同时或交替感染引起的败血症，虽其中有一种主要致病菌，但必须同时报告。对检出的细菌肯定是血中的病原菌的标准是： 3.5.1两次血培养结果为同一细菌。

3.5.2患者2－3周后血中抗体滴度明显升高，应作败血症的病原菌处理。

3.6 对于血培养中出现的细菌，如果暂时鉴定不了或罕见细菌，可作药物敏感试验，将结

果报告临床医生。同时将菌种报上一级单位继续鉴定。

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