植物生理指标检测方法(4)

植物组织游离脯氨酸含量的测定

原理：植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。

材料、仪器设备及试剂 1．材料：植物叶片 2．仪器设备：分光光度计；水浴锅：漏斗：大试管(20m1)；具塞刻度试管(20m1) 注射器或滴管(5～lOml)。 3．试剂：(1)3％磺基水杨酸溶液(2)甲苯；(3)2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mo1.L-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效(4)脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100ug.mL-l。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至lOOml，即成10μg．mL-1的脯氨酸标准液。 1．标准曲线制作（1）取7支具塞刻度试管按表9.2-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。(2)取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色。（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程 9．2．1各试管中试剂加入量

试管 0 1 2 3 4 5 6

脯氨酸标准溶液(m1) 0 0．2 0．4 0．8 1．2 1．6 2．0 水(m1) 2 1．8 1．6 1．2 0．8 0．4 0 冰乙酸(m1) 2 2 2 2 2 2 2 茚三酮显色液(m1) 3 3 3 3 3 3 3 样品测定

（1）脯氨酸提取：取不同处理的剪碎混匀植物叶片0．2～0．5g(干样根据水分含量酌减)，分别置于大试管中，加入5m1 3％磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。 (2)取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2m1，加2m1冰乙酸和3m1显色液，于沸水浴中加热40min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色）。

(3)结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度 脯氨酸含量的百分数。 脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)](C．V)·(a·W)－1

式中：C一提取液中脯氨酸浓度(PS)，由标准曲线求得： V － 提取液总体积（ml） A --- 测定时所吸取得体积（ml） W----- 样品重（g）

实验一植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）

一、 实验目的

学习植物激素的ELISA测定原理，掌握激素测定技术和样品提取方法。

二、 实验原理

免疫测定的方法是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性高且快速、简便、成本低廉、无放射性污染等特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素IAA、ABA、GA3、GA4、iPA、ZR和DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。

ELISA是建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即抗原和抗体反应的高度专一性和敏感性；酶的高效催化特性。ELISA把这而这有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。

ELISA根据均相、非均相以及竞争与非竞争可分为非竞争固相免疫测定、非竞争均相免疫测定、竞争均相、竞争固相测定。常用的免疫测定均为非竞争固相和竞争固相免疫测定统称为酶联免疫吸附测定。所用的吸附载体为聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯酶联板以及硝酸纤维素膜（dot-ELISA）等。目前植物激素的酶联免疫检测方法有三种形式（见下图）：直接法，间接法和简化的间接法。

直接法是在固相载体上直接包被抗体（或先包被二抗，再加一抗。此为直接包被抗体的一种变通形式），利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。 Ab+H+HE=AbH+AbHE

其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HE表示酶标抗原。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HE的量确定时，游离H越多， AbH形成的就越多，而AbHE形成的就越少，即结合在板上的酶标抗原就越少；反之游离H越少， AbH形成的就越少，而AbHE形成的就越多，即结合在板上的酶标抗原就越多。通过检测酶的活性，就可以确定游离H量的多少。

间接法和简化的间接法是包被抗原（间接法）。利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。间接法是竞争后，再加入二抗标记的酶，而简化的间接法是在竞争的同时就加入二抗标记的酶。 Ab+H+HP=AbH+AbHP

其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少；游离H越少，AbH形成的就越少，而AbHP形成的就越多，即结合在板上的抗体就越多。而板上的抗体可以与二抗标记的酶结合，检测酶的活性，就可以确定游离H量的多少。

间接法直接法简化间接法

三、 实验材料、仪器和试剂

1. 材料

新鲜植物材料

2. 仪器设备

研钵，冷冻离心机，氮气吹干装置，酶联免疫检测仪，吸水纸，恒温箱，冰箱，96孔酶标板，可调微量液体加样器（10 μL，40 μL，200 μL，1000 μL），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。

3. 试剂

(1) 包被缓冲液：称取1.5 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 0.2 g NaN（可不加）, 用量筒加1000 mL蒸馏水，3

pH为9.6。

(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0 g NaCl, 0.2 g KH2PO4, 2.96 g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1000 mL蒸

馏水，pH为7.5。

(3) 样品稀释液：500 mL PBS中加0.1 mL Tween-20，0.5 g明胶（稍加热溶解）。

(4) 底物缓冲液：称取5.10 g C6H8O7·H2O（柠檬酸）， 18.43 g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1000 mL蒸馏

水溶解，再加1 mL Tween-20，pH为5.0。 (5) 洗涤液：1000 mL PBS加1 mL Tween-20。 (6) 终止液：2 mol/L 硫酸。

(7) 提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚为抗氧化剂，先用100%甲醇溶解BHT，

再配成80%的浓度。否则BHT 难溶解)。

(8) 各激素包被抗原、各激素抗体、激素标准物和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（间接和简化间接

酶免疫测定用试剂）。各激素抗体、激素标准物和各激素酶标物（直接酶免疫测定用试剂）。

四、 实验步骤

1. 样品中激素的提取

(1) 称取0.5-1.0 g新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20℃的低温冰箱中），

加2 mL样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10 mL试管，再用2 mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。

(2) 4℃下提取4 h，1000 g离心15 min(实验中离心机型号LDZ5-2，约4000 rpm), 取上清液。沉淀中加1 mL

提取液，搅匀，置4℃下再提取1 h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。

(3) 上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是： 80%甲醇（1 mL）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后

用100%甲醇（5 mL）洗柱→100%乙醚（5 mL）洗柱→100%甲醇（5 mL）洗柱→循环。

(4) 将过柱后的样品转入5 mL塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样

品稀释液定容（一般0.5 g鲜重用1.5-3.0 mL左右样品稀释液定容）。

2. 样品测定

(1) 包被：在10 mL包被缓冲液中加入一定量的包被抗原（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀，在酶标

板每小孔中加100 μL。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于37℃下3 h。

(2) 洗板：将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，将下口瓶内的洗涤液通过乳胶管均匀

加入板上，使每孔充满洗涤液，放置约0.5 min,再甩掉洗涤液。重复3次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。

(3) 竞争：即加标准物、待测样和抗体。

a) 加标样及待测样：取样品稀释液0.98 mL，内加20 μL激素的标样试剂（100 μg/mL）,即为2000

ng/mL标准液，然后再依次稀释1000 ng/mL, 500 ng/mL,250 ng/mL,125 ng/mL,62.5 ng/mL，31.25 ng/mL，15.625 ng/mL，0 ng/mL。将系列标准样加入96孔酶标板的前三行，每个浓度加3孔，每

孔50 μL，其余孔加待测样，每个样品重复三孔，每孔50 μL。

b) 加抗体：在5 mL样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签）,混匀后每孔加

50 μL，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。 c) 竞争条件37℃左右0.5 h。

(4) 洗板：方法同包被之后的洗板。但要注意第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。目

的是防止各孔的相互干扰。

(5) 加二抗：将一定量的酶标二抗，加入10 mL样品稀释液中（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀后，

在酶标板每孔加100 μL，然后将其放入湿盒内，置37℃下，温育0.5 h。 (6) 洗板：方法同竞争之后的洗板（步骤4），洗五次，

(7) 加底物显色：称取10-20 mg邻苯二胺（OPD）溶于10 mL底物缓冲液中（小心勿用手接触OPD），完

全溶解后加2-4 μL 30% H202。混匀，在每孔中加100 μL（在暗处操作），然后放入湿盒内，当显色适当后（即0 ng/mL孔与2000 ng/mL孔的OD差值约为1.0左右时），每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。

(8) 比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品492 nm处的OD值。

五、 结果计算与分析

1. 标准曲线

用于ELISA结果计算最方便的是logit曲线。曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/mL ）的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit值的计算方法如下： B/B0 B Logit（B/B0）=ln———— =ln———— 1-B/B0 B0-B

其中B0是0 ng/mL孔的显色值，B是其它浓度的显色值。作出的logit曲线在检测范围内应是直线。待测样品可根据其显色值的logit值从标准曲线计算出所含激素浓度（ng/mL）的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度（ng/mL）。

2. 含量计算

求得样品中激素的浓度后，样品中激素的含量（ng/g·fw）可用下式计算： N·V2·V3·B

A = ————— V1·W

其中，A表示激素的含量（ng/g·fw）； V2表示提取样品后，上清液的总体积；

V1表示进行真空浓缩干燥的上清液体积；（当提取的上清液全部进行真空浓缩干燥时V1与V2的体积是相等的）

V3表示真空浓缩后用样品稀释液定容的体积； W表示样品的鲜重；

N表示样品中激素的浓度（ng/mL）；

B表示样品的稀释倍数（样品稀释液定容以后的稀释倍数）。

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