植物生理指标检测方法(2)

淀粉含量的测定

原理

淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量

(C6H12O6 )n → ( C6H10O5) n + nH2O

糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在 625 nm 波长下的OD值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色 仪器用具和试剂

1. 仪器用具：移液枪、10ml离心管、试管、50ml容量瓶、试管架、棕色瓶（>=500ml）、螺口瓶（>=500ml）、

烧杯、移液管（连续加样器）、离心机、分光光度计； 2. 试剂：

葡萄糖标准液Ⅰ：精确称取0.1000g蔗糖（分析纯），于小烧杯中加水溶解，定容至100ml，加2-3滴浓H2S04，该溶液可长期保存；

葡萄糖标准液Ⅱ:准确吸取1mg/ml的蔗糖标准液5ml，加水定容量50ml，得到浓度为0.1mg/ml蔗糖标准液；

蒽酮溶液：100mg蒽酮溶于50ml浓H2S04（化学纯）中，避光保存，当天配制当天使用； 3mol/L NaOH溶液：12g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水； 3mol/L Hcl溶液：25ml浓盐酸与75ml蒸馏水混匀。 测定方法

1. 植物淀粉相关溶液的提取：向测可溶性糖所剩残渣中加入7ml 3mol/L的盐酸，在沸水浴中煮沸45分

钟，取出冷却，4000转/分离心15分钟，取上清到50ml容量瓶中，加入7ml 3mol/L NaOH，用蒸馏水定容到50ml，作为待测样品。

2. 标准曲线的配制：吸取0.1mg/ml葡萄糖标准液按下表加入至11支试管： 0.1mg/ml 葡糖(ml) 蒸馏水(ml) 葡糖浓度（mg/ml） 蒽酮试剂(ml) 0 0 2 0 8.0 1 0.1 0.9 0.01 4.0 2 0.2 0.8 0.02 4.0 3 0.3 0.7 0.03 4.0 4 0.4 0.6 0.04 4.0 5 0.5 0.5 0.05 4.0 6 0.6 0.4 0.06 4.0 7 0.7 0.3 0.07 4.0 8 0.8 0.2 0.08 4.0 9 0.9 0.1 0.09 4.0 10 1.0 0 0.1 4.0 45℃水浴中显色10~15分钟，625 nm 处测OD值 3. 准确吸取待测液1.0ml，加蒽酮4.0ml，在45℃水浴中显色10-15分钟，各管在加入蒽酮试剂时要迅速，

加完后用力振荡混匀。

4. 取出后避光冷却，在 625 nm处测OD值，从标准曲线上得到提取液中可溶性总糖含量。 结果计算

葡萄糖糖含量（%）=标准曲线对应含糖量×定容体积×100／（样品质量×显色吸取液体积×103） 粗淀粉含量（%）=葡萄糖含量×0.9 强酸溶液，注意安全

超氧化物歧化酶(SOD)的测定 一、 实验原理

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC 1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基O2·ˉ，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大吸收。而SOD可清除O2·ˉ，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性的大小。

二、 实验材料、仪器和试剂：

1. 材料

小麦叶片或其他植物组织

2. 仪器设备

高速离心机；分光分度计；微量进样器；荧光灯(反应试管处理度为4000 Lx)；试管或指形管数支。 3. 试剂

(1) 1.50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)。

(2) 2.130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399 g Met用磷酸缓冲液定容至100 mL。

(3) 3.750 μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.06133 g NBT用磷酸缓冲液定容至100 mL，避光保存。 (4) 4. 100 μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721 g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 1000 mL。 (5) 5. 20 μmol/L核黄素溶液：称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1000 mL避光存。

三、 实验步骤：

1. 显色反应

取5 mL指形管数支，测定管数目依据处理而定，另4支为对照管，按表2依次加入下列各溶液对照管用缓冲液代替酶液，蒸馏水0.25 mL。将其中2支对照管置于暗处，其它置于4000 Lx日光下反应20 min左右，主要看颜色的变化，全部变成灰色，对照可能较浅。

2. 测定

待反应结束，以不照光的对照管做空白，依次测定其它各管的吸光值。 表2 各溶液显色反应用量

试剂(酶) 0.05 mol/L磷酸缓冲液 130 mmol/L Met溶液 750 μmol/L NBT溶液 100 μmol/L EDTA – Na2液 20 μmol/L核黄素 酶液 /缓冲液（对照） 蒸馏水 总体积 用量(mL) 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 0.2 3.0 终浓度(比色时) 13 mmol/L 75 μmol/L 10 μmol/L 2.0 μmol/L 对照管以缓冲液代替酶液 四、 结果计算与分析

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性 SOD比活力

(Ack?AE)?VT[u/g(FW)]?0.5?Ack?W?VtSOD总活性[u/mg(蛋白)]?蛋白质含量式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 Ack —照光对照管的吸光度。 AE —样品管的吸光度。 VT —样品液总体积，mL。 Vt —测定时样品用量，mL。 W —样品鲜重，g。

蛋白质含量单位为mg/g。

五、 注意事项

1. 配好的Met溶液须在4℃冰箱中保存备用，以防止Met活性损失。

2. 配好的NBT溶液须放入棕色试剂瓶，并在4℃冰箱中保存备用，以防止NBT见光分解。 3. 配好的核黄素溶液须放入棕色试剂瓶避光保存。

六、 思考题

1. 在 SOD 测定中为什么设照光和暗中两个对照管 ? 2. 影响本实验准确性的因素是什么 ? 应如何克服 ?

实验六植物抗氧化酶活性的测定

酶液的提取

称取新鲜植物叶片0.5 g置于研钵中，加入5 mL 4oC下预冷的浓度为50 mmol/L，pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10 mL离心管中，在4 oC冰箱中静置10 min，于15000 rpm/min下冷冻离心25 min，上清液即为过氧化物粗提液。4 oC下保存备用。

1．过氧化氢酶(CAT)的活性测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而导致H2O2累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内的核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除植物体内的H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。

一、 实验原理

H2O2在240 nm波长下有强吸收，过氧化氢酶(Catalase, CAT, EC 1.11.1.6)能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

二、 实验材料、仪器和试剂

1. 材料

小麦叶片或其他植物组织

2. 仪器设备

紫外分光光度计，离心机，研钵，25 mL容量瓶1个，刻度吸管0.5 mL 2支，2 mL 1支，10 mL试管3支，恒温水浴锅。 3. 试剂

(1) 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮)。 (2) 0.1 mol/L H2O2 (用0.1 mol/L高锰酸钾标定)。

三、 实验步骤：

取10 mL试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管(将酶液煮死)，按表1顺序加入试剂。

表1 紫外吸收待测样品测定液配制表

试剂(酶) 粗酶液(mL) pH 7.8磷酸缓冲液(mL) 蒸馏水(mL) 管号 S0 0.2 1.5 1.0 S1 0.2 1.5 1.0 S2 0.2 1.5 1.0 25 oC预热后，逐管加入0.3 mL 0.1 mol/L的 H2O2，每加完1管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240 nm下测定吸光度，每隔l min读数1次，共测4 min，待3支管全部测定完后，计算酶活性。

四、 结果计算与分析

以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(μ)。

过氧化氢酶活性

式中： ΔA240 —— AS0 –(AS1+AS2)/2。 AS0 ——加入煮死酶液的对照管吸光度。 AS1、AS2 ——样品管吸光度。 Vt ——粗酶提取液总体积(mL)。 V1 ——测定用粗酶液体积(mL)。 FW ——样品鲜重(g)。

0.1 —— A240每下降 0.1为 1 个酶活单位(μ)。 t ——加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

注意：凡在 240 nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

?A240?VT[u/(g?min)]?0.1?V1?t?FW五、 注意事项

1. 试剂中的H2O2的浓度对测定结果影响较大，要注意标定的准确性。

2. 缓冲液中必须加PVP，以防止酶活性降低。

六、 思考题

1. 影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？

2. 超氧化物歧化酶(SOD)的测定 七、 实验原理

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC 1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基O2·ˉ，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大吸收。而SOD可清除O2·ˉ，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性的大小。

八、 实验材料、仪器和试剂：

1. 材料

小麦叶片或其他植物组织

2. 仪器设备

高速离心机；分光分度计；微量进样器；荧光灯(反应试管处理度为4000 Lx)；试管或指形管数支。 3. 试剂

(6) 1.50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)。

(7) 2.130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399 g Met用磷酸缓冲液定容至100 mL。

(8) 3.750 μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.06133 g NBT用磷酸缓冲液定容至100 mL，避光保存。 (9) 4. 100 μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721 g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 1000 mL。 (10) 5. 20 μmol/L核黄素溶液：称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1000 mL避光存。

九、 实验步骤：

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