植物生理指标检测方法

植物组织中可溶性糖含量的测定

在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为 NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。

Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖

一、原理

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。

糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物鲜样或干样。 （二）试剂 1. 80 ％乙醇。

2. 葡萄糖标准溶液（ 100 μg/mL ）：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。

3 ．蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 ～ 3 周。 （三）仪器设备

分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、 0.5 mL ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。 三、实验步骤

1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品 0.5 ～ 1.0 g （或干样粉末 5 ～ 100 mg ），放入大试管中，加入 15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸 20 min ，取出冷却，过滤入 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。

2. 标准曲线制作取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。

表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量

试剂 100 μg/mL 葡萄糖溶液（ mL ） 蒸馏水（ mL ） 蒽酮试剂（ mL ） 葡萄糖量（ μg ） 管号 0 0 1.0 5.0 0 1 0.2 0.8 5.0 20 2 0.4 0.6 5.0 40 3 0.6 0.4 5.0 60 4 0.8 0.2 5.0 80 5 1.0 0 5.0 100 将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ）为横坐标绘制标准曲线。

3 ．样品测定取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。 四、结果计算

溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100

式中： C ——从标准曲线查得葡萄糖量， μg 。 V T ——样品提取液总体积 , mL 。 V 1 ——显色时取样品液量， mL 。 W ——样品重（ g ）。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位/mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

1．考马斯亮蓝法 一、 实验原理

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465 nm，后者在595 nm。在一定蛋白质浓度范围内（0-100 μg/mL），蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1 h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

二、 实验材料、仪器和试剂

1. 材料

小麦叶片或其他植物组织

2. 仪器设备

分光光度计，离心机，研钵，25 mL容量瓶1个，刻度吸管0.5 mL 2支，2 mL 1支，10 mL试管3支。 3. 试剂

(1) 牛血清白蛋白配成1000 μg/mL和100 μg/mL。

(2) 考马斯亮蓝G-250：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸

100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL。此溶液在常温下可放置一个月。 (3) 90%乙醇

(4) 磷酸（85%，W/V）

三、 实验步骤：

1. 可溶性蛋白的提取

称取新鲜植物叶片0.5 g置于研钵中，加入5 mL 4oC下预冷的浓度为50 mmol/L，pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10 mL离心管中，在4 oC冰箱中静置10 min，于15000 rpm/min下冷冻离心25 min，上清液即为过氧化物粗提液。4 oC下保存备用。

2. 标准曲线的绘制

(1) 0-100 μg/mL标准曲线的制作

取6支试管，按下表数据配制0-100 μg/mL血清白蛋白液各1 mL。准确吸取所配各管溶液0.1 mL，分别放入10 mL具塞试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2 min后，在595 nm下比色，绘制标准曲线。

配制0-100 μg/mL血清白蛋白液

管号

1

2

3

4

5

6

100 μg/mL牛血清蛋白量(mL) 蒸馏水量(mL) 蛋白质含量(mg)

(2) 0-1000 μg/mL标准曲线的制作

0 1.0 0

0.2 0.8 0.02

0.4 0.6 0.04

0.6 0.4 0.06

0.8 0.2 0.08

1.0 0 0.10

另取6支试管，按表10-2数据配制0-1000 μg/mL牛血清白蛋白溶液各1 mL。与步骤（1）操作相同，绘出0-1000 μg/mL的标准曲线。 配制0-1000 μg/mL血清蛋白血液

管号

1000 μg/mL牛血清白蛋白（mL） 蒸馏水量(mL) 蛋白质含量(mg)

7 0 1.0 0

8 0.2 0.8 0.2

9 0.4 0.6 0.4

10 0.6 0.4 0.6

11 0.8 0.2 0.8

12 1.0 0 1.0

3. 样品提取液中蛋白质浓度的测定

吸取样品提取液0.1 mL（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595 nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

四、 结果计算与分析

C?样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=

VaW式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；

V－提取液总体积（mL）； a－测定所取提取液体积（mL）； W－取样量（g）。

叶绿素测定方法

1、 称取剪碎叶片0.2g，放入容量瓶。 2、 加50ml 95%的乙醇。

3、 遮光浸提48-72小时，中间摇晃一次。（保证各批次浸提时间一致） 4、 分光光度计测吸光值，三波长（649，665，470），分别对应叶绿素a、b和其他。空白为95%乙醇。

计算公式如下： CA=13.95*D665-6.88*D649 CB=24.96*D649-7.32*D665 C其他=(1000*D470-2.05*CA-114.8CB)/245 C 单位：mg/L 叶绿素a=CA*0.05/2 叶绿素b=CB*0.05/2 叶绿素其他=C其他*0.05/2 叶绿总叶绿素含量为三者之和。 一般叶绿素a/b为3：1至4：1

选择的波长不一样，计算公式就不一样，网上也有其他的波长方法，计算公式里的系数响应也有差异。

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