内皮细胞培养步骤(总结,)(3)

研 究表明长期清除受者天然抗体和抑制补体系统以防止血管排斥反应可能并非必不可少。根据ABO血型不相容同种移植经验，在移植物植入前后去除天然抗体和补体 及抑制其他因子，一段时间后即使天然抗体和补体及其他因子恢复到正常水平后也不能刺激内皮细胞活化引起排斥反应，其可能原因是在移植物植入后且天然抗体 “不存在”的期间，移植物内皮细胞有相当的时间从低温暴露，低氧应激和再灌注所造成的损伤中恢复正常。在异种移植中也可观察到同样的现象[2]，如 Bach等用抗μ抗体和抗IgM-XNA免疫抑制剂清除IgM-XNA数周后植入异种器官，获得延迟排斥效果，数周后即使天然抗体水平恢复，也不出现排斥 反应[27]。 Delirouras等[25]发现，猪内皮细胞暴露于低水平的人类抗体中，6天后可以获得对抗TNF-α介导的凋亡的能力。说明这种异种抗体与异种移植 物内皮细胞的相互作用对异种移植还有着“积极”的一面。 Cooper对之作了定义[28]：如果应用抑制天然抗体和补体的方法，使异种移植物存活一定时间（2～3周），而后停止治疗，若在天然抗体和补体滴度回 升时，排斥反应仍不发生，这一现象称为“适应” （accommodation），也被称为机体对抗体和补体的“获得性抵抗力”。适应表现为：① 改变抗移植物抗体，使更少的抗体与移植物结合或结合力减弱；② 改变人体器官内皮细胞上的抗原表达，如靶物质的糖类加上唾液酸基因，可保护它们不与天然抗体结合；③ 改变移植物血管对抗体和补体损伤的易感性等。而内皮细胞的变化可能是上述改变的本质原因[2]。

在未处理的受者，一旦异种移植器官血流再通，它的 每个内皮细胞上就有多达100 000个天然抗体分子的沉积，随后导致补体沉积，内皮细胞将在几秒或几分钟内被突然大量地损伤。若在移植前去除天然抗体和补体，则可允许它们有机会慢慢恢 复而“痊愈”，不产生内皮细胞如此大量地损伤。“痊愈”的内皮细胞在其对恢复的天然抗体应答中，可能积极干扰超急性排斥反应的内皮细胞应答过程。首先，内 皮细胞受刺激后的初期不仅出现转录因子NF-κB的活化（NF-κB在许多特征性基因的上调中起重要的作用），而且也出现一个编码I-κB（NF-κB抑 制因子）样分子的基因上调，I-κB蛋白能与NF-κB结合而抑制NF-κB功能，这样，依赖于NF-κB而上调的基因及其可能参与超急性排斥反应的基因 产物将不能上调，因而在造成“适应”的一定条件下I-κB活性超过NF-κB，可防止内皮细胞活化，从而引起“适应”，而不是超急性排斥反应。其次，有条 件地刺激内皮细胞既可诱导内皮细胞对反应产生的毒素敏感，又可诱导其对相同毒素的适应[2]。 三、内皮细胞和补体

在异种移植导致移植物损 伤中受者补体起到关键的作用，其激活是异种排斥反应发生的基本步骤。通常认为异种移植中补体激活是由异种天然抗体所触发，抗体特异性与异种移植 物内皮细胞结合，粘附C1q ，启动补体经典途径。但另有研究发现，猪内皮细胞也可以同时激活人补体激活的经典和旁路途径[2]。研究发现，补体在内皮细胞活化，导致HAR过程中起着 重要的作用。补体与天然抗体沉积在

内皮细胞表面，活化补体成分可把信号传递给内皮细胞，促进内皮细胞活化。此外，补体裂解产物如C5a具有诱导中性粒细胞 趋化、化学活化、脱颗粒和呼吸爆发的功能，以及可增强中性粒细胞整合素与内皮细胞上配体的亲和力。C5a还可以刺激巨噬细胞和肥大细胞释放TNF和IL- 1，而TNF和IL-1又可以活化内皮细胞，且这些细胞亦可直接以活化形式与内皮细胞结合，进一步加剧排斥反应[2]。 研究发现1%的人补体即可 激活猪内皮细胞，导致内皮细胞上的硫酸肝素的丢失，5％的补体可以刺激猪内皮细胞从抗凝状态转变为促凝状态。但补体并不能像细胞因子那样直接激活内皮细 胞，而是通过诱导IL-1α分泌来激活内皮细胞。应用IL-1受体拮抗剂和抗IL-1抗体可以抑制补体激活内皮细胞而导致的凝血和炎症反应，从而证实了 IL-1在补体激活内皮细胞机制中的重要作用[29]。

目前大致采用2种主要方法防止补体激活：① 应用高纯度眼睛蛇毒因子或可溶性补体受体I 来消耗补体；② 利用转基因技术使异种移植物血管内皮细胞表达人源补体调节蛋白来抑制补体的活化。尤其在利用转人源补体调节蛋白基因方面取得了一定的进展，人补体调节蛋白 主要包括衰变加速因子（DAF/CD55）、膜辅助因子（MCP/CD46）、膜反应性溶解抑制物（MIRL/CD59）等。其中CD46能抑制Ｃ3转化 酶形成，从而抑制补体的激活。CD59可以阻断攻膜复合体（MAC）的形成，避免其对移植物的损伤。DAF可以抑制C3b和MAC在猪内皮细胞上的沉积 [30] 。近年来在异种移植研究中发现，利用转基因技术使猪内皮细胞表达人补体调节因子的转基因

猪在一定程度上可以抑制天然抗体所介导的补体活化，使移植物免遭超 急性排斥反应的损伤作用[31，32,33]。最近的研究还表明表达人类补体调节因子CD46，DAF和CD59的猪能够合成与人类自身相似的补体调节蛋 白质[34], 并且联合转染多种补体调节蛋白基因的转基因猪的效果明显优于转染一种补体调节因子，例如，转DAF和CD59的转基因猪效果优于转染单一DAF的转基因 猪；联合转染CD46与DAF也有相似的效果[35]。另外Shiraishi等[36]应用腺病毒载体介导CD55、CD46和CD59三个基因联合转 染猪血管内皮细胞，可以明显的抑制补体激活，其效果也远远优于转染单一基因。

四、 内皮细胞与凝血

异种移植常伴随显著的凝血 功能异常，血小板活化及血管损伤。实际上移植物血管内凝血是异种移植排斥反应的特征之一[37]。凝血过程的激活与受者免疫应答关系密切，在血管化异种移 植中纤维蛋白沉积与血小板聚集是复杂排斥反应过程中免疫和炎症反应的结果。在这一机制中，内皮细胞的激活与否起到十分关键的作用[2]。 正常的内 皮细胞表面含有许多有助于抗凝和行使其他功能的分子，其中最重要的2种为硫酸肝素和血栓调节素。硫酸肝素由一个蛋白质核心和与之相连的糖胺聚糖链组成，当 抗凝血酶Ⅲ与硫酸肝素连结后即活化成为一种强有力的抗凝剂，干扰凝血途径中的关键成分凝血酶及其他因子的作用；与硫酸肝素连结的还有超氧化物歧化酶 （SOD），它可以破坏与活化内皮细胞连结的活化中性粒细胞所产生

的氧基团（O2-）。血栓调节素可与凝血酶结合，使血液中存在的蛋白C（PC）成为活化 PC（APC），与血液中另一成分蛋白S一起通过破坏凝血因子Ⅴa和Ⅷa来干扰凝血途径的激活，进而阻碍血栓形成，即具有抗凝作用。ATPDase (CD39) 是表达在静息内皮细胞表面的另一种分子，当内皮细胞激活后其活性降低。ATPDase有将腺苷酸三磷酸（ATP）和腺苷酸二磷酸（ADP）代谢成腺苷酸环 腺苷一磷酸（AMP）的功能。在5’－核苷酸酶的作用下，AMP转变为腺苷酸。ADP可以强烈刺激血小板聚集，ATP和ADP都可以刺激多种细胞变为致炎 细胞。所以ATPDase去除ATP、ADP可以消除ATP、ADP的促凝血和致炎的刺激。另外，腺苷酸也有抗凝血、抗炎症刺激的功能，所以 ATPDase还可以通过促进腺苷酸的合成来抑制血小板聚集和炎症反应[38]。

内皮细胞活化后，使血管的完整性受损与基质相联的组织因子 （tissue factor, TF）增加。活化内皮细胞表面也可表达TF，这些TF的暴露，使得活化内皮细胞因子Ⅶ或因子Ⅶα能与之结合，启动外源性凝血过程。另外活化的内皮细胞激活 补体，引起补体连锁激活启动的凝血途径可能也是异种移植排斥反应中广泛血栓形成的部分原因[2]。正如Fecke 等发现非协调性异种移植排斥反应依赖于天然抗体和猪内皮细胞上的Galα1,3-Gal天然抗原的相互作用。这种相互作用使补体活化，且活性物质沉积于细 胞膜上导致内皮细胞功能紊乱和血栓形成[39]。其中多种机制可造成抗凝（与静息内皮细胞相关）和促凝（与活化内皮细胞相关）之间的失衡[2]：①血小板 活化因子

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库内皮细胞培养步骤(总结,)(3)在线全文阅读。