黑曲霉产柠檬酸(5)

丝球缠绕较为紧密，且形成了外围舒展的菌丝，无大量散落菌丝体分散在发酵液中，较有利于柠檬酸发酵。 (2) (NH4)2SO4 添加量对柠檬酸产量的影响

有实验证明在柠檬酸发酵的过程中，发酵培养基中除了添加有机氮源外，同时添加一定量的(NH4)2SO4 对柠檬酸产量有较明显的提高。这是因为在柠檬酸发酵的过程中，特别是在柠檬酸发酵过程的后期，开始添加(NH4)2SO4，铵离子对菌体生长无影响，同时铵离子对柠檬酸积累有调节作用，从 NH4+的代谢调节作用考虑，柠檬酸生产菌黑曲霉的 PFK 酶是糖酵解途径中第一个调节酶，也是决定 EMP途径代谢流量的最重要的关键酶。此酶受柠檬酸和 ATP 的抑制，受 AMP、Pi、NH4+所激活，NH4+不仅能激活 PFK 酶，还能解除柠檬酸、ATP 对它的抑制作用。研究黑曲霉柠檬酸发酵过程发现， NH4+在细胞内胜利浓度范围中浓度的高低与柠檬酸生产率有密切的关系。所以 NH4+在发酵过程中，尤其在产酸阶段不应受限。也有文献报道，在我国过去用树干粉为原料发酵柠檬酸时，添加 0.01%-0.05% (NH4)2SO4，不但可以提高产酸，而且能够缩短柠檬酸的发酵周期。不同 (NH4)2SO4 添加量对以玉米粉为原料柠檬酸发酵产酸量的影响见图 3.5：

从图 3.5 可知，黑曲霉 Wys-03 以玉米粉为原料发酵柠檬酸时，发酵液中(NH)4SO2 的添加量在 0.3%时，产酸量较高，同时发酵残糖含量较低。发酵液中(NH)4SO2 添加量高于或者是低于 0.3%，都会是产酸量有所下降，同时残糖含量有所提高，使得糖酸转化率下降。所以，本实验采用发酵液中添加 0.3%的(NH4)2SO4，以提高产酸 3.5.1.3 培养基组份优化

为了确定柠檬酸发酵中各培养基营养组份的最佳条件，以影响柠檬酸发酵过程中的重要因素初始总糖浓度(g/v%)、玉米液化全液添加量(v/v%)和硫酸铵含量(g/100ml)进行三因素三水平的正交试验，最终以发酵液中柠檬酸含量(g/100mL)为指标，确定出最佳实验方案。各因素水平安排见表 3.4。

在无菌条件下，将斜面试管培养成熟的黑曲霉 Wys-03 孢子接入到二级种子培养基中(10%初糖，pH4.5)中，35±1℃，150r/min 恒温摇床振荡培养 24h，镜检菌丝球发育状况，将二级种子培养液接入发酵液中进行柠檬酸发酵培养。以影响柠檬酸发酵过程中的重要因素：初始总糖浓度(v/v%)、接种量(%)和(NH4)2SO4 含量(g/100ml)进行三因素三水平的正交试验，最终以发酵液中柠檬酸含量(%)和残糖（以还原糖计）含量（%）为指标。结果如表 3.5。

通过表 3.5 的正交实验可以看出，在黑曲霉 Wys-03 柠檬酸发酵过程中，培养基的三个营养因子对柠檬酸发酵的影响大小顺序是：初始总糖浓度(g/v%)＞(NH4)2SO4 添加量(g/100ml)＞玉米液化全液添加量(v/v%)。从正交实验表中可以看出，最优培养基成分是：18%的初糖含量，17%的玉米液化全液添加量，0.3%的(NH4)2SO4 添加量效果最好。但是正交实验中并没有做这个实验，而实验 4 与本最佳实验最为相似。为了确定最优发酵条件，根据上述最优方案进行了一次柠檬酸发酵实验，发酵最终柠檬酸含量为 13.64g/100mL，高于正交试验中的实验 4，所以选择最优方案为以后的发酵营养条件。 3.5.2 非营养因子对柠檬酸产量的影响

控制发酵培养基中的营养因子可以有效的提高柠檬酸的发酵产量，但是影响柠檬酸发酵的不止有发酵培养基中的营养因子同时还有发酵工艺参数。

3.5.2.1pH 值对柠檬酸产量的影响

由于酶活受 pH 值的影响十分明显，所以发酵培养基中不同 pH 直接影响发酵微生物的代谢过程，同时发酵培养基的 pH 还对微生物的生长影响较大。由于发酵过程中的 pH 不合适，可能影响菌体的生长发育进而影响菌种产物的合成的速率和能力，因此了解不同发酵微生物的最适发酵 pH 对于提高发酵产物的产量有重要的意义 （1）发酵液初始 pH 对柠檬酸发酵的影响：

相对于大工业发酵罐发酵，实验室内的摇床三角瓶发酵，调节合适的发酵初始 pH 值十分重要。特别是像柠檬酸发酵这种以淀粉作为发酵原料的发酵，发酵液初始 pH 的高低会直接影响到菌体糖化酶的活力，由于柠檬酸发酵是以玉米粉为原料的发酵过程，属于边糖化边生长边产酸的过程。初始 pH 值过低，会直接导致糖化酶活性低，淀粉不能完全水解，同时较低发酵 pH 值，会生成亚铁氰化物，该化合物对黑曲霉菌体的生长有毒害作用。反之如果发酵液初始 pH 值较高，会使发酵过程中草酸和葡萄糖酸大量积累，使发酵液中杂酸含量过高。不同发酵液初始 pH 值对柠檬酸发酵产量的影响，见图 3.6。

由图 3.6 可可以看出，黑曲霉 Wys-03 在进行柠檬酸发酵时，只有发酵液初始pH 为 4.5 时，产酸率最高。如果发酵液初始 pH 调节过高或者过低时，都会对最后的产酸率有影响。究其原因主要是，pH4.5 与糖化酶的活性最高 pH 值基本一致，如果起始 pH 低于 4，则低于糖化酶的作用最适范围，会使得发酵原料得不到充分利用，进而影响最终产酸率。反之如果发酵液初始 pH 过高，pH 值大于或者等于6，则黑曲霉菌丝球会出现老化现象，提前进入衰老期，如果初始发酵 pH 值更高还会引起菌体自溶。所以，发酵液初始最适 pH 值为 4.5。

（2）柠檬酸发酵过程中 pH 值的变化

黑曲霉接种到发酵培养基以后，首先会分泌并利用自身的糖化酶系，将发酵液中未液化完全的大分子多糖水解为单分子葡萄糖，供给黑曲霉自身生长发育以及合成柠檬酸，如果发酵前期由于各种原因使得黑曲霉过早进入到发酵产酸期，由于柠檬酸的积累从而引起发酵液

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