黑曲霉产柠檬酸(3)

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盐酸 琼脂 碘化钾 氢氧化钠 分析纯 莱阳化工有限公司

次甲基蓝 碘 酚酞 酒石酸钾钠 葡萄糖 耐高温 α-淀粉酶 2 万酶活/mL 糖化酶 2 万酶活/mL 玉米粉 土豆 3.2.4 仪器设备

10L 全自动发酵罐 瑞士Bioengineering AG

空压机 龙海力霸通用机械有限公司

PH 电极；pH2050e panel 瑞士 Bioengineering AG

氧电极；DO4050e panel 瑞士 Bioengineering AG 3.3 实验方法

3.3.1 初糖含量对柠檬酸发酵的影响 (1) 初糖浓度对菌体生长的影响

在无菌状态下，分别调整发酵液初始糖浓度为 10%、14%、18%、20%，24%，在玉米液化清液中添加 17%玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵开始后，每隔 6h 分别从各个不同初糖浓度的发酵液中吸取 1ml，进行菌丝体净重测量，记录净重变化。

(2) 初糖浓度对柠檬酸产酸的影响

在无菌状态下，分别调整发酵液初始糖浓度为 10%、14%、18%、20%，24%，在玉米液化清液中添加 17%玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。 3.3.2 氮源含量对柠檬酸发酵的影响 (1) 有机氮源的需求量

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中分别添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

(2) (NH4)2SO4 添加量对柠檬酸产量的影响

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，再分别添加 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

3.3.2 氮源含量对柠檬酸发酵的影响 (1) 有机氮源的需求量

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中分别添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

(2) (NH4)2SO4 添加量对柠檬酸产量的影响

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，再分别添加 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。 3.3.3 温度对柠檬酸发酵的影响

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，分别在 30℃，33℃，36℃，39℃，42℃温度下，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

3.3.4 接种量对柠檬酸发酵的影响

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，分别按 6%，8%，10%，12%，14%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

3.3.5 通风量对柠檬酸发酵的影响

采用 10L 全自动通风机械搅拌发酵罐，玉米粉液化清液添加 17%玉米粉液化全液，定容到8L ，添加0.3%的(NH4)2SO4，调节初始pH4.5，转速250～300r/min，。通风量 12h 前：0.12VVM；12h-72h：0.15VVM，35±1℃，培养 72h。从发酵 16h开始每隔 6h 取样，测定发酵液中柠檬酸积累量、还原糖消耗量和 pH 值的变化情况。 3.4 测定方法

1.柠檬酸测定方法：（粗测法）采用 0.1429mol/L 氢氧化钠溶液滴定。 2. 还原糖测定：发酵液稀释后，由斐林试剂直接测定。 3. 总糖测定：发酵液经酸水解后，由斐林试剂测糖法测定。 4. 氮含量测定：凯氏定氮法。

5. pH 值测定：酸度计测定或者是精密 pH 试纸测定。 6. 菌丝球大小测定：测微计测定。 7. 孢子计数：血球计数板计数法测定

8. 菌丝球干重的测定：取出一定量的发酵液，离心机中 3000r/min，离心 30min，

用蒸馏水洗两遍后，倒掉清液，在烘箱中烘干后称重，记为菌丝净重。 9. pH 值测定：酸度计测定或者是精密 pH 试纸测定。 10. 菌丝球大小测定：测微计测定。 11. 孢子计数：血球计数板计数法测定

12. 菌丝球数量测定：吸取 1mL 生长成熟的种子培养基，进行一定倍数的稀释，

在显微镜下进行直接计数 13. 糖酸转化率计算公式如下: 糖酸转化率 （% ）=

C?100% A?B 式中 C——最终柠檬酸酸度(g/100mL)； A——发酵液起糖浓度(g/100mL)； B——发酵结束糖浓度(g/100mL)； 14. 产酸速率计算公式如下：

产酸速率（ g/100ml?h）=

C1?C2 T式中 C1——发酵最高酸度(g/100mL)； C2——发酵起始酸度(g/100mL)； T——总发酵时间(h)。 3.5 结果与讨论

3.5.1 培养基成分对柠檬酸产量的影响

在柠檬酸发酵过程中，发酵初期黑曲霉会利用培养基中的营养成

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