16S rDNA鉴定细菌的方法

16S rDNA鉴定细菌的方法

细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：

1.提取细菌基因组DNA,

2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。

6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树

试剂：

1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.4 10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。 1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。

6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。

8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。

10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。

12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。

13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。

15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避

免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。）

1.1细菌基因组DNA提取

基本步骤：

材料准备

破碎细胞或胞膜—内容物释放

核算分离、纯化

沉淀或吸附核酸，并去除杂质

核酸溶解在适量缓冲液或水中

基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪

细菌基因组DNA提取方法综述

细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。

1 快速微量提取法

? 取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 ? 加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于

o

37C水浴1hr。

? 然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。 ? 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

? 加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm

离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

2 蛋白酶/SDS法制备

? 用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp. ? 4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA

pH8.0）洗菌体2次。 ? 将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，

轻轻混匀后50℃放置3h-5h。

? 用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。 ? 乙醇沉淀DNA。

? 用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适

当1×TE或ddH2O中。 3

? 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。 ? 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重

新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。 ? 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS

110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）。 ? 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，

室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）。

? 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10。 ? 洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。

? 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。

4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL

? Grow cells overnight in 500 ml broth medium.

? Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50

mM EDTA.

? Freeze cell suspension at -20C

? Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and

let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.

? Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place

in 50C water bath for 60 min.

? Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15

min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.

? Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by

inverting).

Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.

? Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at

10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.

? Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by

inverting).

? Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA

? Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.

5 CTAB/NaCl裂解法

? 接两环菌（0.75ml甘油管菌液）于25ml LB培养基中，37℃、200r/min培养24h。 ? 取1.5ml菌液于1.5ml Eppendorf 离心管中，8000r/min离心5分钟,弃去上清。 ? 加入1.5ml TE离心洗涤后,用567 ul TE溶解菌体,混匀。 ? 加入30μl 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K（100 ug/ml），混匀，于37℃温育1h。 ? 加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。

? 加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8ml）,混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。 ? 上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5

分钟,保留上清。

? 加入0.6倍的异丙醇（0.48ml）,轻轻混合直到DNA沉淀下来（0.5h）,12000r/min离

心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。

? 用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。

? 用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6μl (4μl样品+ 2μl loading

buffer) , 80 V , 电泳1.5小时。

2.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增

一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27F/1492R。 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 2.1 实验原理 2.1.1 PCR

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。

ＰＣＲ技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。

PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理

2.1.2 16SrDNA的核酸序列分析

16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常

用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。

2.1.3 PCR法的操作过程

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