干细胞分裂模式和干细胞干性维持的机制研究(4)

课题三：miRNA和蛋白质修饰在干细胞对称/不对称分裂过程中的作用及机理 研究目标：

我们的近期工作发现miRNA和蛋白质修饰可导致细胞重编程（Cell Stem Cell, in press），本课题将深入研究miRNA和蛋白质修饰是否通过调控干细胞对称不对称分裂从而影响干细胞干性的获得和维持，阐述miRNA和蛋白质修饰与细胞周期及特异信号转导系统之间的相互作用关系，探索miRNA和蛋白质修饰与在果蝇及线虫模式动物中已知的和新发现的调控干细胞对称不对称分裂的关键分子的上下游关系，使我们得以全面系统地理解干细胞干性维持及获得的机理。

研究内容：

1. 明确特异miRNA和蛋白质修饰（尤其是组蛋白修饰）是否通过调控干细胞对

称不对称分裂影响干细胞干性的获得和维持。

A. 在miRNA 302/367集群/let-7诱导多能干细胞过程中，观察重编程的干细

胞分裂模式。

B. 分析组蛋白修饰HDACs调控的重编程过程中干细胞的分裂模式。 C. 确定HDAC1和HDAC2缺陷的ES 细胞中对称不对称分裂的比例及其与干

性维持的相关性。

2．研究miRNA和蛋白质修饰与转录因子、细胞周期及特异信号转导系统之间的相互作用关系。

A. 采用免疫沉淀Argonaute-RISCs-基因芯片技术鉴定miRNA 302/367集群

/let-7下游靶信号基因是否涉及干细胞核心转录因子、Wnt、Notch、FGF、TGFb等信号转导通路、细胞周期调控信号分子、细胞凋亡调控信号分子和染色质重塑分子等，证实miRNA 302/367/let-7可影响这些信号分子，调控细胞分裂模式，获得并维持干细胞干性。

B. 研究组蛋白修饰，尤其是组蛋白去乙酰化酶（HDACs）修饰，是否通过

特异信号转导系统及细胞周期的关键因子调控干细胞分裂模式和干性获得和维持。

C. 在HDAC1和HDAC2缺陷的ES细胞中，观察特异的信号转导系统或影响

细胞周期的关键因子是否缺失。

3. 探索miRNA和蛋白质修饰与从果蝇及线虫模式动物中已知的和新发现的调控干细胞对称不对称分裂的关键分子的相互作用关系。

A. 建立特异的miRNA启动子报告体系，研究其与已知的如PAR-aPKC蛋白

复合物（PAR蛋白等）、Notch、Wnt 信号通路分子以及干细胞标记（CD133, CD117）和转录因子Gata6等的作用关系。

B. 研究组蛋白修饰，尤其是组蛋白去乙酰化酶（HDACs）修饰，与已知的

调控干细胞对称不对称分裂的关键分子的哺乳类同源分子的作用关系。 C. 用以上方法，探讨miRNA和蛋白质修饰与从果蝇及线虫模式动物中新发

现的调控干细胞对称不对称分裂的关键分子的作用机制。

4. 利用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析蛋白质修饰（尤其是组蛋白修饰）

以探索蛋白质修饰与干细胞对称不对称分裂的关系。

A. 系统分析HDACs敲除小鼠细胞组蛋白以及其它蛋白质修饰，尤其是乙酰

化的变化。

B. 系统分析干细胞分化 (包括对称与不对称分裂) 前后组蛋白修饰的变化，

为探明蛋白质修饰调控干细胞干性维持的机制提供依据。

承担单位：同济大学、中国科学院生物物理所 课题负责人：张玉珍，教授，同济大学 学术骨干：俞作仁、杨福全、李丽 预算经费：23％

课题四：运用果蝇和线虫研究调控干细胞对称和不对称分裂的新机制 研究目标:

利用模式动物果蝇和线虫研究所具备的直观、高效、快捷等技术优势，依据同源蛋白在不同的动物里往往具有类似的生理生化功能的原理，结合遗传学、细胞生物学、生物化学、分子生物学和发育生物学的实验方法，研究特异哺乳类干

细胞标记物（如前列腺干细胞CD133+、CD117+）表面特征在果蝇和线虫中相应的同源基因的功能和分子机理，尤其在组织干细胞不对称分裂方面的作用新机制，从而揭示及探讨其小鼠同源基因对于细胞分裂模式在哺乳类干细胞干性维持中的生理功能，并为上皮干细胞对称/不对称分裂调控与干性维持研究提供新的信息和研究方向。

研究内容:

1. 在果蝇和线虫中，揭示干细胞标记物如CD133和CD117同源基因的功能及突

变体的表型。

A. 在果蝇中，重点研究CD133同源基因CG42310、CG7740和CD117同源

基因CG8222对神经干细胞的分裂模式及上皮细胞形成及结构维持的作用。利用遗传方式，明确CG42310与CG7740之间的关系。

B. 在线虫egl-15（CD117)和F08B12.1（CD133）突变体内，利用高分辨率活

体时序显微成像技术，通过荧光标记不同的细胞器（如纺锤体、染色体和细胞膜等），比较肌肉干细胞以及表皮干细胞不对称分裂动态过程。 C. 验证模式动物果蝇线虫实验结果与小鼠实验的相关性。

在果蝇和线虫突变体里验证小鼠CD133和CD117基因的相关功能，并分析GFP标记的鼠源CD117和CD133蛋白在果蝇和线虫里的亚细胞定位和动态变化。

2. 阐明果蝇和线虫CD133和CD117同源蛋白的亚细胞定位

A. 构建果蝇基因G42310、CG7740和CG8222及线虫基因EGL-15及F08B12.1

融合蛋白质粒，并制备相应抗体。免疫荧光标记观察其在不同发育期亚细胞定位。

B. 构建表达绿色荧光蛋白GFP融合蛋白的果蝇和线虫品系，观察同源蛋白

在细胞周期不同阶段的动态变化。

3. 阐明CD133及CD117的分子通路。

A. 选择CG42310、CG7740及CG8222做诱饵，利用二次亲和纯化

（Tandem-Affinity-Purification TAP）和质谱分析的方法，发现新的结合蛋

白，并分析其功能。

B. 利用正向遗传学（如EMS诱变的方法）筛选抑制线虫egl-15突变体在线

虫产卵（egg-laying）表型方面的抑制子（suppressor），发现egl-15分子通路及上、下游的基因。

C. 阐明二次亲和纯化方法识别的果蝇蛋白生理功能及线虫正向遗传学筛选

到的基因功能，确认它们是否与上述CD133、CD117同源蛋白作用在同一信号通路上。

D. 发现小鼠内与这些新基因同源的基因，与其它课题组合作，检测其与对

称/不对称分裂调控及对前列腺干细胞干性维持的分子功能。

承担单位：浙江大学、中国科学院生物物理所 课题负责人：严庆丰，教授，浙江大学 学术骨干：杨小杭、李薇、席咏梅 预算经费：25％

四、年度计划

年度 研究内容 预期目标 1. 利用干细胞的标记物（譬如CD133、1. 建立可行的哺乳类干细胞的CD117）、中心体和纺锤体的标记物、免疫组化及实时成像等方法，研究哺乳类干细胞在组织正常发育过程中或在成纤维细胞重编程过程中细胞的分裂模式、干细胞对称与不对称分裂的比例及其作用。 分裂模式实时成像观察系统，结合免疫组化，阐述干细胞对称与不对称分裂在哺乳类组织正常发育过程或在成纤维细胞重编程过程中的作用及机制。 2. 在特异miRNA（302/367集群）和2. 阐明特异miRNA和蛋白质修蛋白质修饰（HDACs）调控重编程饰通过调控干细胞对称不对称分裂模式影响干细胞干性的获得和维持。 3. 明确干细胞标记物CD133和CD117三个同源基因第 过程中，运用标记荧光蛋白实时示踪成像技术观察重编程的干细胞分裂模式。 一 3. 在果蝇中，重点研究干细胞标记物 年 CD133同源基因CG42310、CG7740和CD117同源基因CG8222对神经干细胞分裂模式及上皮细胞形成及结构维持的作用。 4. 在线虫egl-15（CD117同源基因)和CG42310、CG7740和CG8222的蛋白功能及变异体表型，揭示干细胞表面特征抗原CD133和CD117的蛋白功能及信号分子机理。 F08B12.1（CD133同源基因）突变4. 明确CD117蛋白的线虫同源体内，利用高分辨率活体时序显微成像技术，通过荧光标记不同的细胞器（如纺锤体、染色体和细胞膜等），比较干细胞不对称分裂动态过程。

基因对调控线虫干细胞不对称分裂的影响；揭示F08B12.1同源蛋白在线虫发育过程中的生理功能。

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