干细胞分裂模式和干细胞干性维持的机制研究(3)

4) 本项目组成员首次在果蝇中发现并鉴定了Pins及Gαi在神经干细胞不对

称分裂中的功能，并发现纺锤体不对称几何形态受到富集在神经干细胞上部的两个且功能互补的蛋白复合体调控。另外，还发现转录因子Snail家族蛋白亦参与不对称分裂的调控。这些关于干细胞不对称分裂分化调控的一系列重要成果多次发表在Cell、Genes & Dev、EMBO J等刊物上。 5) 在线虫细胞不对称分裂研究领域，本项目组成员首次发现了一种新分子

能够调节微管切割蛋白（katanin）的表达水平，进而阐明了调控胚胎不对称细胞分裂的新机制，成果发表在Journal of Cell Biology上。 这些工作基础将为这一项目研究提供丰富的实验体系与独特的实验手段。

（五）课题设置

根据总体研究目标和研究内容，本项目拟以干细胞对称与不对称分裂和干细胞的干性维持为核心，以哺乳类上皮干细胞为突破点，将项目分解为各有侧重，但又互相联系、互相促进的四个课题（见总体思路图），从信号转导、细胞周期、miRNA和蛋白质修饰、果蝇线虫遗传学等方面有机结合地、深入系统地探索干细胞分裂模式在干细胞干性维持中的作用及其机制。

从各课题研究所利用的不同体系和所侧重的不同角度来看，课题一着重应用哺乳类上皮干细胞中干细胞对称与不对称分裂和干细胞干性维持研究体系，系统研究信号转导在其中的参与及作用；课题二研究细胞周期相关因子对干细胞干性获得和维持的作用及其机理；课题三从miRNA和蛋白质修饰的角度研究其在干细胞对称和不对称分裂过程中的精细调控；课题四运用果蝇和线虫模型，发现新的决定干细胞分裂模式的关键分子，为创新药物的研发提供靶标。

从各课题间的有机联系及与项目预期目标的关系来看：

课题一聚焦哺乳类上皮干细胞，为干细胞对称与不对称分裂和干细胞干性维持的研究提供了一个重要的独特体系。 课题二中影响细胞周期的因子、课题三中的miRNA和蛋白质修饰以及课题四果蝇和线虫中新发现的关键分子的作用都将可以在这一系统中进行验证。

课题二利用诱导多能干细胞系统研究细胞周期改变与干性获得的关系，阐明这一过程中的细胞分裂模式，并为其它课题包括模式动物中发现的关键因子从逆向的角度进行验证，同时在这一系统中发现的新的关键因子可在其它系统中进行研究。

课题三分析特异miRNA及蛋白质修饰调节细胞分裂模式诱导维持重编程多能干细胞干性的分子机制，并研究在病变情况下miRNA及蛋白质修饰对干细胞分裂方式与干性的作用，与课题一密切相关。同时miRNA调控细胞分裂模式及其特异靶点，如细胞周期调控信号分子、细胞凋亡调控信号分子和染色体重塑分子等，与课题二紧密联系。此外，这些特异miRNA及蛋白质修饰分子与课题四发现的调控干细胞分裂模式的分子也可互为进一步研究的切入点。

课题四的研究利用模式动物果蝇和线虫直观、高效、快捷的实验手段和技术，寻找参与调控对称/不对称分裂模式的新基因，并明确其在模式动物中的功能和分子机理。本课题可为课题一、二、三提供新的研究思路和整体动物水平的验证平台，并创新性地阐明哺乳类干细胞对称与不对称分裂和干细胞干性维持的作用机制。

各课题具体设置如下：

课题一：干细胞分裂模式对干细胞干性的调控机制。 研究目标：

阐明哺乳类干细胞对称分裂和不对称分裂、特异信号转导系统与干细胞干性维持之间的相互关系。揭示干细胞不对称分裂在组织发育、再生修复及病理变化过程中的作用机制。验证新的调控干细胞不对称分裂的关键分子如何通过特异的信号通路影响干细胞的干性维持及其在临床的应用潜能。

研究内容：

1. 干细胞对称与不对称分裂在哺乳类组织正常发育过程中的研究。

在哺乳类上皮组织(前列腺、脑、内耳)正常发育过程中，利用干细胞的标记物、中心体和纺锤体的标记物、以及已知的在果蝇或线虫系统中发现的与对称与不对称分裂相关的标记物，采用实时光学影像、荧光标记、双光子/近红外/多光谱及高分辨率荧光显微影像等技术和免疫组化，根据纺锤体的方向、干细胞分裂

的位置（细胞核上下振荡行为）、分裂板的夹角（垂直、水平以及介于中间）、子细胞位置大小及形态上的差异、特异分子在细胞质中的不对称分布等指标，观察上皮干细胞在体外三维类器官形成过程中或培养的组织切片或活体胚胎中干细胞的分裂模式和干细胞对称与不对称分裂的比例。

A. 实时追踪体外经纯化、分离、三维培养的干细胞形成类器官（Organoid）

的过程。

B. 利用特异的转基因荧光报告蛋白，实时追踪培养的组织切片或活体胚胎

中干细胞的分裂分化过程。

C. 利用免疫组织化学技术，在不同的发育点，观察体内特定微环境下的干

细胞分裂模式及分化过程。

2. 从特异信号转导系统这一角度，进行干细胞对称和不对称分裂如何影响哺乳

类干细胞干性维持的机制研究。

A. 研究Notch信号转导系统及其相关的分子与哺乳类干细胞分裂模式及干

细胞干性维持的关系，包括Numb、Hes、Atoh1等。

B. 研究Wnt信号转导系统与哺乳类干细胞分裂模式及干细胞干性维持的关

系，包括beta-catenin、Wnt5a、Frizzled、Axin2等。

C. 研究Shh信号转导系统与哺乳类干细胞分裂模式及干细胞干性维持的关

系，包括Shh、Patched、Gli1等。

3. 进一步深入系统地研究哺乳类干细胞对称和不对称分裂的分子机制。

A. 上皮干细胞干性因子（Bmi、Nanog等）及表面标志分子（CD117、CD133

等）及对上皮干细胞对称和不对称分裂的影响。

B. 采用宫体胚胎电转导和RNAi技术，研究快速基因干扰相关中心体蛋白基

因（CP110、CDK5RAP2等）对神经上皮干细胞对称和不对称分裂的影响。 C. 利用课题二中获得的细胞周期相关因子，研究其和哺乳类干细胞对称和

不对称分裂的关系及在上皮组织发育中的作用。

D. 利用课题三中miRNA和蛋白质修饰，研究其和哺乳类干细胞对称和不对

称分裂的关系及在上皮组织发育中的作用。

E. 利用课题四中果蝇和线虫里已知的及新发现的调控干细胞不对称分裂及

其干性的分子，研究其和哺乳类干细胞对称和不对称分裂的关系及在上皮组织发育中的作用。

F. 探索以上这些因子和特异信号转导通路的上下游关系，及其在哺乳类上

皮干细胞干性维持中的作用。

4. 研究在上皮组织再生修复及病理变化包括癌变过程中干细胞分裂模式和干

细胞干性维持的作用及机理。

A. 利用免疫组织化学技术，在组织再生修复、重建过程中不同的时间点，

观察体内特定微环境下的干细胞分裂模式及分化过程。

B. 采用干细胞标记物（CD133、CD177、CD44等），从肿瘤组织中纯化、

分离、三维培养干细胞，观察其克隆及细胞球形成及在体成瘤过程中干细胞的分裂模式及分化过程。

C. 探索课题二、三、四中有潜力的关键靶标因子对上皮组织再生修复及病

理变化包括癌变可能的临床应用。

承担单位：上海交通大学、中国科学院生物物理所 课题负责人：高维强，教授，上海交通大学 学术骨干：魏勋斌、王晓群、杨茹 预算经费：28％

课题二：细胞周期调控干细胞干性的获得及其机理 研究目标：

从干细胞多能性获得与细胞周期、分裂模式之间的关系与调控机理着手，结合影响细胞分裂模式、细胞周期变化的关键因子研究，从干性获得的角度逆向解读干细胞的干性与细胞周期、分裂模式之间的关系与调控机理，力争取得新的突破。

研究内容：

1. 研究细胞重编程过程中的细胞分裂模式。

A. 利用小鼠成纤维细胞高效快速重编程体系，结合荧光标记和实时观测显

微技术，研究细胞重编程过程中的细胞分裂模式。

B. 利用基因芯片等技术，检测现有重编程过程中不同时间点的细胞分裂模

式关键基因（PAR蛋白等）表达变化。

C. 根据实时观测和基因芯片表达分析结果，研究影响分裂模式的关键基因

与Oct4等重编程因子之间的关系。

2. 全面分析重编程过程中细胞周期的变化与iPS细胞干性获得之间的关系。

A. 利用小鼠成纤维细胞高效快速重编程体系，结合荧光标记和实时观测显

微技术，研究细胞重编程过程中的细胞周期变化。

B. 利用基因芯片等技术，结合前期结果中发现Vc可以提高重编程效率，检

测不同条件重编程过程中，不同时间点的细胞周期关键基因(Cyclins、CDKs、p27等)表达变化。

C. 根据实时观测和基因芯片表达分析结果，研究影响细胞周期的关键基因

与Oct4等重编程因子见关系。

3. 利用iPS系统研究细胞周期、分裂模式关键因子，系统研究Numb等关键因

子通过调节细胞周期来决定细胞命运的可能机制。

A. 结合前期研究结果，研究Numb基因在细胞重编程过程中的表达变化，

并研究其与重编程因子Oct4之间的关系。

B. 研究果蝇、线虫模型中发现的分裂模式、细胞周期关键因子在细胞重编

程过程中对细胞干性获得的影响及作用机制。

C. 研究Numb在iPS细胞分化过程中调节不对称分裂的作用。

D. 在细胞重编程系统中，研究细胞分裂模式、细胞周期关键因子与重编程

因子Oct4、Sox2、Klf4等协同作用之间的关系和作用机理。

承担单位：中国科学院广州生物医药与健康研究院、四川大学 课题负责人：苏焕兴，副研究员，中国科学院生物医药与健康研究院 学术骨干：Miguel A Esteban、李红昌 预算经费：24％

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