2019大脑中动脉缺血再灌注大鼠脑组织PAR

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大脑中动脉缺血再灌注大鼠脑组织PAR

作者：周青珍， 王华梅， 吴家幂

【摘要】 目的:研究脑缺血再灌注（CIR）后脑组织中蛋白酶激活受体

1(PAR

1）的表达及其与炎症反应的关系。 方法:40只雄性

1表达与炎症反应的关系

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

SD大鼠线栓法建立大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，再灌注后于3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d取脑，免疫组化法和脑组织匀浆法检测PAR1、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量。 结果:缺血再灌注后脑组织PAR

1表达增加（P＜0.01），MDA含量增多（P＜

1表达与MDA含量正相关

0.01），SOD活性降低（P＜0.01）；PAR

（r1=0.844,P＜0.05），与SOD含量负相关（r2=-0.901,P＜0.01）。 结论:CIR后PAR

1表达增多可加重脑组织炎性反应。

1

【关键词】 大脑中动脉;栓塞；蛋白酶激活受体

Abstract: Objective To investigate the correlation between protease

activated receptor

1(PAR

1) expression and

inflammatory reaction of brain tissue after cerebral ischemia reperfusion(CIR).Methods Fourty SD rats were randomly divided

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into eight groups:sham group,CIR3 h,CIR6 h,CIR12 h,CIR1 d,CIR2 d, CIR3 d,and CIR7 d group(n=5).To establish middle cerebral artery occlusion(MCAO) model with Longa’ methods.At the indicated timepoint,the rat was sacrificed and its brain was removed.PAR

1 was detected with immunohistochemistry,SOD and

MDA contents in brain homogenate were measured.Results Compared with sham group,PAR

1 expression was increased

obviously（P＜0.01）.Contents of MDA were increased with the time of CIR prolonged（P＜0.01）,and there was positive correlation between PAR

1 expression and MDA content

（r1=0.844,P＜0.05）,but SOD activity was decreased（P＜0.01）,and negatively correlated with PAR（r2=-0.901,P＜0.01）. Conclusion Increased PAR

1 expression1 expression

may aggravate inflammatory reaction of brain tissue in rats after CIR with MCAO.

Key words: Middle cerebral artery;Occlusion;Proteaseactivated receptor

1

近年来研究发现中性粒细胞的聚集、黏附和浸润，以及炎性因子的大量产生是缺血再灌注损伤的重要因素[2]。脑缺血再灌注（cerebral ischemia reperfusion,CIR）后中性粒细胞在凝血酶作用下趋化于缺血组织周围，通过激活蛋白酶激活受体-1（proteaseactivated receptor

1,PAR

1）导致细胞内Ca2+升高，刺激

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小胶质细胞的活化和增生[3]，促进炎症因子表达，活化的白细胞释放自由基，引起脑缺血后脑组织损害。本实验通过建立大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,了解CIR后脑组织中PAR

1表达与代表自由基水平的超氧化物歧化酶

（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）之间的相关性， 以探讨PAR 1 材料和方法 1.1 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠40只，体重270～320 g(南京青龙山实验动物养殖中心提供），随机分为8组：假手术组，缺血再灌注3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d组（n=5）。 1.2 脑缺血再灌注模型的制备

选用日本产钓鱼尼龙线，直径0.2 mm，每段长4 cm，头端烧成杵状备用。参照Zea Longa报道的线栓法[1]建立大鼠大脑中动脉栓塞MCAO模型。术后2 h，外拉尼龙线，使其球端回至颈外动脉残端，恢复大脑中动脉供血，实现再灌注，于上述不同时间点断头取脑；假手术组除插入尼龙线15 mm外，余步骤同手术组，术后24 h断头取脑。 1.3 免疫组化染色

在相应时间点，大鼠深度麻醉后，打开腹腔，由左心耳灌注生理盐水100 mL,再用4%甲醛内固定后断头取脑。标本置中性福尔马林中固定、包埋。按下述步骤行PAR

1免疫组化染色：切片、微波修复1在CIR后脑组织炎症反应中的作用。

抗原、3%过氧化氢抑制、兔血清封闭、加一抗（山羊抗小鼠多克隆抗

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体，美国Santa Cruz公司）、4 ℃过夜、加生物素二抗（兔抗山羊IgG）、加SABC、DAB显色，苏木素复染。 1.4 脑组织匀浆制备及SOD、MDA含量测定

将左侧脑组织称重后置于玻璃匀浆管内,0.9%的生理盐水作为匀浆介质（是脑组织的9倍）,充分磨碎使脑组织匀浆化,离心15 min,取上清液,即为10%脑组织匀浆。SOD、MDA含量测定严格按试剂盒说明书进行。

1.5 结果分析

高倍镜下随机选取左侧海马皮质相邻而不重叠的4个视野区，用图像分析软件计算PAR方差分析，所得PAR

1阳性表达细胞数。用SPSS 11.0软件进行1、SOD、MDA值用均数±标准差(x±s) 表示，

P＜0.05有统计学意义。 2 结果 2.1 PAR

1表达和SOD、MDA含量

1表达明显增多，3 d时达

与假手术组相比，CIR 3 h后 PAR

高峰（P＜0.01）；SOD活性显著降低（P＜0.01），且随时间变化延长而逐步降低，3 d时最为明显；MDA含量开始升高（P＜0.01），3 d达高峰(见表1)。 2.2 相关性分析 PAR

1阳性表达细胞数与脑组织匀浆SOD含量呈负相关关系

（r2=-0.901,P＜0.01），但与MDA含量呈正相关关系（r1=0.844,P＜0.05）（见表1）。表1 PAR

1表达与SOD、MDA含量变化注：*P

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＜0.01； 3 讨论

脑缺血再灌注后，缺血以及缺血激活的内皮细胞可导致中性粒细胞聚集、黏附和浸润， 黏附的白细胞可释放大量氧自由基和蛋白水解酶[4]。自由基对脑组织的损害集中表现为OH-对细胞器生物膜中不饱和脂肪酸的丙烯双键进行攻击，使之结构破坏，流动性降低，通透性增加，甚至完全裂解，最终导致细胞内脂质过氧化,引起细胞凋亡。膜脂质降解产生的主要代谢产物MDA常用来反应细胞膜脂质过氧化程度，通过测量MDA的量可间接反映氧自由基水平；SOD活性代表内源性氧自由基清除活力，脑缺血继发损伤后，一系列自由基反应可直接损伤DNA、酶蛋白，从而使SOD的活性减弱或消失，SOD合成和再生减少。本实验发现，CIR后MDA含量随再灌注时间的延长进行性升高，而SOD活性随再灌注时间的延长逐渐降低，提示脑组织中有大量自由基产生，内源性氧自由基清除活力下降。

研究表明，凝血酶的细胞外效应在脑组织缺血损伤中起重要作用，其细胞外效应由凝血酶受体(thrombin recptor,TR)介导[5]。PAR1是TR之一，在脑组织中分布广泛，对凝血酶的介导作用最强[6]。脑缺血再灌注后，脑组织产生大量凝血酶，通过栓系配体模式[6]激活PAR

1,引起PAR

1表达增多，对脑细胞产生直接的毒性效应，

并通过受体途径激活神经元和神经胶质细胞，使之产生并释放大量的细胞因子及毒性物质而损伤血脑屏障[7]。有报道[8] 认为：凝血酶是重要的前炎症因子，可上调肿瘤坏死因子（TNF

α）、细胞间粘

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