Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程
V． 结果分析
酶切步骤结束后，应向上述 10 μl 反应体系内加入 2μl 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测或置 于-20℃保存。当酶切后片段预计<500 bp 时，推荐使用 1.5%～2%的琼脂糖凝胶电泳，若酶切片段的大小 相近且需要将其分开显示，可提高琼脂糖凝胶浓度并延长电泳时间，凝胶最大浓度推荐≤2.5%。
试剂盒中 Positive Control DNA 为杂交后的 DNA 片段，经 CruiserTM 核酸酶切割后形成三个明显片段， 分别为 393 bp、134 bp、259 bp，其中 134 bp 和 259 bp 片段是酶切后片段，而 393 bp 片段为杂交形成 的 homo-duplex DNA 片段，无酶切割位点，因此，片段大小不变。
Figure 2 阳性对照的电泳结果 M： 100 bp-DNA Marker CK+： Positive Control DNA
※注意：酶切验证阳性的克隆，若需要进行测序，需以第一轮 PCR 产物为模板，使用相应的高保真 DNA 聚合酶、Nested Primer 引物进行扩增，回收片段送测序即可。
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VI． FAQ
Q-1：电泳结果仅有原片段而无酶切条带？
A-1：造成该实验结果有以下几种可能：
a． DNA 片段中无突变位点，需要重新进行上游实验，可通过对该 DNA 片段进行测序验证； b．DNA 片段中杂交 DNA 含量过低，致使反应后条带不易观察到。该情况常见于 cell pool 检测中，因 cell
pool 中阳性克隆(靶基因突变细胞)比例过低，导致获得 DNA 片段中杂交 DNA 含量过少，此时 建议
TM
设立 2-3 个重复分别进行 PCR 检测，只要检测到 Cruiser酶切条带，则可认为敲除成功，存 在阳性克隆。 c． CruiserTM 核酸酶失活。使用试剂盒中的阳性对照同步进行实验以检测活性。
Q-2：电泳结果中酶切条带大小不是预期大小？ A-2：出现该情况表明制备的 DNA 片段中含有其他杂交位点。首先，应确认制备的 DNA 片段是否存在其他 DNA 的污染；其次，根据酶切结果进行判定：若酶切后形成的各条带单一，可能在 DNA 片段上含有其他 杂交位点，需通过 DNA 测序检测；若形成的酶切条带数量远多于预期，且随机分布含一定弥散，则可能是 DNA 片段扩增中，DNA 聚合酶错配扩增导致，使用高保真 DNA 聚合酶重新进行扩增可消除影响。如果 PCR 反应出现非特异性扩增的条带，也会导致同样情况，建议调整 PCR 反应条件，以保证只有特异性扩增的 PCR 产物用于突变检测。
Q-3：反应后，酶切的条带轻微弥散？ A-3：该现象可能原因如下：
当酶切后条带<200 bp，且经较长时间的核酸电泳，条带宽度变大，亮度不足时呈现类似弥散的带型； 当突变位点过长，尤其当突变长度达到 50 bp 以上时，酶切后条带易出现弥散现象，此时弥散程度会因酶 切后条带大小的不同而不同，片段越小弥散情况越明显。
Q-4：CruiserTM Enzyme 检测结果是否会出现假阳性？ A-4：CruiserTM Enzyme 是通过基因工程生产的 Cel I 同源核酸内切酶，具有更好的稳定性、高度的特异性 和高效性，它能够切割所有形式的碱基突变形成的异源 DNA 双链。目前为止，尚未有文献报道使用 CruiserTM Enzyme 或 Cel I 会出现假阳性，或出现其他核酸酶活性。
Q-5：电泳结果中酶切条带大小与预期一致，就一定是纯合子吗？ A-5：因为杂交的 DNA 片段是通过巢式 PCR 得到的，所以特异性没有任何问题。在得到与预期一致的酶切 条带后，不能 100%判断该样本为纯合子，因为杂合子也能得出同样的结果。因此，需要进行 PCR 片段的 TA 克隆和测序验证。
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VII．附录
附录 A 阳性对照说明
等量野生型和突变型 DNA 片段混合，经 98℃加热、自然冷却后形成的杂交 DNA，该 DNA 链存在两 处突变，均为单碱基突变，突变点间距 2 bp，如下图所示。经 CruiserTM 核酸酶切割后形成三个明显片段， 分别为 393 bp、134 bp、259 bp，其中 134 bp、259 bp 为酶切形成的片段，393 bp 为杂交形成的 homo-duplex DNA 片段，无酶切割位点， 因此，片段大小不变。
200 ng。 阳性对照推荐用量：10 μl 体系用量
附录 B 目的 DNA 制备说明
提取基因组 DNA 后，在设计 First Primers 用于第一轮 PCR 时，要求其具有较高的特异性，其扩增产 物推荐为 500～1000bp，Nested Primer 推荐扩增产物长度为 300～600 bp。在设计 Nested Primer 时，应 使突变位点位于片段的 1/3～2/3 处，且反应后获得的片段大小不应小于 100 bp，以尽可能增强酶切结果的 可观察性。例如：使用第二轮（巢时）PCR 扩增获得全长为 400 bp 的 DNA 片段，通过调整引物位置，使 得预计的突变位点位于距 5’-端 140 bp 处，则 CruiserTM 核酸酶酶切后获得片段应为 140 bp、260 bp。若以 1.5%～2.0%琼脂糖进行凝胶电泳检测则可获得 3 条清晰的片段，大小分别为 140 bp、260 bp、400 bp。 在
进行 CRISPR-Cas9、TALEN 和 ZFN 技术进行基因敲除的检测时，推荐检测的 DNA 片段大小为 300～ 600 bp；若用于长片段扩增突变检测，片段大小不受限制，但需适当延长反应时间，如调节反应时间为4 5 min；片段在凝胶电泳时应呈现清晰的单一条带。
附录 C 酶切效果说明
野生型和突变型模板 DNA 混合后进行巢式 PCR 是为了获得特异性的序列和足够的量，巢式 PCR 必须 采用试剂盒中的 5×Nested Buffer、Mg2+ Buffer 和 GNest DNA polymerase 进行反应，以确保不影响后续 CruiserTM 酶切反应。
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VIII. 参考文献
1. Yang B, Wen X, Kodali N S, Oleykowski C A, Miller C G, Ku-linski J, Besack D, Yeung J A, Kowalski
D, Yeung A T. Purification, cloning, and characterization of the CEL I nuclease. Bio-chemistry, 2000, 39:
3533～3541.
2. Perry J A, Wang T L, Welham T J, Gardner S, Pike J M, Yoshida S, Parniske M. A TILLING reverse
genetics tool and a accessible collection of mutants of the legume Lotus japonicus. Plant Physiology, 2003,
131: 866～871.
3. McCallum C M, Comai L, Greene E A, Henikoff S. Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(TILLING)
for Plant Functional Genomics. Plant Physiology, 2000, 123: 439～442.
4. Oleykowski C A, Mullins C R B, Godwin A K Yeung A T. Mutation detection using a novel
plant endonuclease. Nucleic Acids Research, 1998, 26: 4597～4602.
5. Wienholds E, Eeden F V, Kosters M, Mudde J, Plasterk R H A, Cuppen E. Efficient target-selected
mutagenesis in Zebrafish. Genome Research, 2003, 13: 2700～2707.
6. Till B J, Burtner C, Comai L, Henikoff S. Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases. Nucleic
Acids Research, 2004, 32: 2632～2641.
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