Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程

未来的中国科学家们，加油！ Genloci Classic CRISPR-Cas9内

部操作流程

Protocol No. PT140726-1

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程

1，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：

1 ～20bp

-3’ - CACC G 5’

-5- CAAA ’ 3’

设计2条单链oligo序列；退 火形成双链DNA。

2 将双链 DNA连接到载体中。

3 转化 G10 Competent Cell；筛 选阳性克隆；测序验证序列； 质粒大提；电转染靶细胞。

4 在细胞内 crRNA识别靶位点， Cas9对靶位点进行随机剪切。

5

CruiserTM酶切细胞池，计算突变 率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆； 将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。

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U6 pGK1.1

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2，操作步骤

实验前，请您务必做好以下验证实验：

A． 单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可

以形成单克隆。 B． 目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增

靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。

1. 设计Oligo DNA序列

首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计： ●麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/

●德国癌症研究中心的E-Crisp：www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr

下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。

点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”

根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与BbsI酶切后的载体相互补的部分）： Fut8-F: caccGAATGAGCATAATCCAACGCC Fut8-R: aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC

※注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。

另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。

将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。

2. T4 DNA Ligase连接

将合成后的2条单链oligo DNA退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1 linear vector是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于T4 DNA Ligase连接反应，pGK1.1载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。

Protocol No. PT140726-1

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退火反应体系如下：

正链Oligo(100μM) 负链Oligo(100μM)

ddH2O

Annealing Buffer(20x)

0.5μl

0.5μl 18μl 1μl 20μl

将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1.75μl的杂交后的双链DNA进行T4 DNA Ligase连接反应，反应体系如下：

pGK1.1 linear vector 2μl

1.75μl 双链DNA

T4 DNA Ligase 1μl 10xT4 DNA Ligase Buffer 1μl ddH2O 4.25μl 10μl

※注意：请您根据步骤1自行设计正链Oligo序列和负链Oligo序列，合成后的2条单链 oligo DNA退火复性成双链DNA，再进行T4 DNA Ligase连接反应。

连接产物可以直接转化DH5a高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克隆实验指南》，pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。

3. 电转染靶细胞(推荐)

转染前进行质粒大提，确保质粒浓度≥2μg/μl浓度，再取4～7μg进行电转染靶细胞，推荐使用Celetrix细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106。

另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。

4. 混合克隆pool检测

48-72小时后做有限稀释，一般5块板足够，并取电转后细胞的pool 1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞冻存。

PCR检测（以Fut8基因为例）：

11步骤所制备的模板 5ul

Fut8-seq-F(10mM): 1ul Fut8-seq-R(10mM): 1ul dNTP Mixture(10mM each): 1ul Taq酶： 0.5ul 10XTaq酶buffer： 5ul Mgcl2 3ul

H2O: 33.5ul Total 50ul 程序： 95℃ 2min cycles 1x 95℃ 20S

cycles 35x X℃ 20S

72℃ 30S

72℃ 5min cycles 1x 95℃ 变性 5min

}

PCR产物使用CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1%-1.5%凝胶电泳。

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5. CruiserTM筛选阳性克隆

上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。

将剩余的pool的靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用Cell Plaza?(Cat.No.: GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组，推荐使用Genloci TNA抽提试剂盒 (Cat.No.: GL10851S)。

然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用Genloci CruiserTM突变检测试剂盒(Cat.Nos.: GCMD025, GCMD100)，对CruiserTM筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。

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