综述： 质粒DNA生产工艺的研究进展(3)

评价细胞免疫的方法（如特异性CTL反应的方法或Elispot方法等），也可通过对细胞因子的定量检测评价其细胞免疫情况，如属于常规检定项目，该类方法应稳定、重复性好、可操作性强，并制定相应的质量标准。若有动物模型，可进行动物保护性实验。

佐剂或呈递物质的质量评价：如在最终重组DNA制品含有佐剂或呈递物质，则应建立检测该类物质的量以及与重组DNA结合率的方法，并制定质量标准。 六、质粒DNA的应用

伴随着基因工程技术的快速发展，DNA疫苗及基因治疗的优势已被在多个领域证实，而DNA疫苗和基因治疗最终必需是依赖质粒的形式来发挥作用。 6.1 DNA疫苗

DNA疫苗是上世纪九十年代发展起来的新技术，即将外源基因克隆到真核表达载体上构建DNA疫苗质粒，DNA疫苗经过各种途径注射到动物基体内后，可被宿主细胞吸收和摄取，进入宿主细胞的细胞核中转录成mRNA，再在胞浆中翻译成蛋白质。其中一部分蛋白质在降解后与MHCⅠ类分子结合，并被递呈到细胞表面被CD8 T细胞的受体识别，而激活细胞毒T细胞的活性；另一部分蛋白质也可以分泌出去，再像外源蛋白一样被抗原提呈细胞摄取，在吞噬溶酶体内降解成多肽，并进一步与MHCⅡ类分子结合，有抗原提呈细胞提呈到细胞表面被Th2细胞的受体识别，然后由Th2细胞分泌的细胞因子作用于B细胞，而刺激以抗体产生为主的体液免疫[4]。DNA疫苗不仅可诱导产生体液免疫，而且可诱导强烈而持久的细胞免疫，还可避免向外界排毒，而且DNA疫苗与减毒和弱毒疫苗不一样，其不存在毒力反强等问题。其安全性及高效性是传统疫苗所达不到的，所以，该技术在病毒、细胞内寄生所引起的传染病、寄生虫以及肿瘤防治中显示出巨大的潜力。Wolff[128]首先对重组质粒可以在小鼠体内表达进行了报道，外源蛋白可以在小鼠体内表达长达60天，提示质粒DNA可以在体内相当一段时间内进行表达，可以用作治疗性作用，并顿时引起了广泛的研究。 6.2 基因治疗

基因治疗对于癌症、动脉粥样硬化、骨质疏松、关节炎、阿耳茨海默氏病等

因为特定基因活动异常而引起的疾病的预防和治疗很有前景[8]。该疗法是一种将核酸引入人细胞以用来修改它们的遗传特性而达到治疗目的的治疗策略。通常，该核酸是能够编码起治疗作用，破坏作用或者标记作用的蛋白质的双链 DNA分子(dsDNA)。该核酸也可能是与宿主细胞里的目标序列结合，通过阻止 mRNAs或者启动子来抑制特定基因表达的反义 RNA 或者单链 DNA(ssDNA)。

至今，以质粒为基础的基因治疗、癌症疫苗等已经超过了600例，质粒DNA的基因免疫模拟了病原体在细胞内的基因表达途径，已经成功地应用来治疗下肢的局部缺血，心血管再生，并极有希望通过核酸疫苗来预防现代医学的疑难杂症，包括疟疾、艾滋病、乙肝和结核病等。对于基因治疗，质粒不能整合入基因组DNA也许是个缺点，但是质粒可以附加体的形式存在于细胞核中，也可以持续表达相当长的一段时间。 七、质粒DNA的给予途径

用作DNA免疫或基因治疗的一个前提是要有效地将核酸转入靶细胞。并且除了反义疗法外，核酸必须到达细胞核区中。可以通过病毒载体或者非病毒载体将DNA运送到靶细胞的细胞核中。经过遗传改造的病毒载体，如逆转录病毒，腺病毒，单胞疹病毒和其它病毒系统在转运效率上可能比非病毒载体要高，但是由于它们的毒性和免疫原性，以及致癌基因或者肿瘤抑制基因的可能激活和抑制，用病毒载体来传递基因的手段已经引发了安全和规则性的顾虑。所以，非病毒性载体系统变得更加可取，成为商业产品中最具吸引力的基因转移系统[129]。自从 1995 年以来，被批准的用于基因治疗程序中的质粒 DNA 转运载体的数目呈现指数级上升，质粒DNA在正进行的基因治疗试验中占了大约 25％[130]。

大量实验指出，肌肉注射是接种 DNA 疫苗的有效方法，除肌肉细胞外，表皮、粘膜和静

脉内注射都可以使外源基因进行表达，产生免疫效果。为了达到好的免疫效果，可将表达重组体包埋于脂质体内进行注射，这种方式比用裸 DNA 直接注射效果好。 八、质粒DNA的安全性问题

质粒DNA已经进入临床试验，在中国，命名为“今又生”的含有p53的基因药物业已上市，该类制品不同于一般的化学药品，药理、毒理和药物动力学的实验要求具有特殊性，因此，该制品的药理学实验主要包括发生作用的原理、生物效价与剂量的关系、免疫程序和接种途径与效果的关系等；在毒理学方面主要考虑接种部位的病理反应、机体产生的抗核酸抗体反应、基因整合和必要时的致瘤性分析等；药代动力学主要包括重组DNA的分布、持续时间等。由于以上各方面互相关联，因此，将药理、毒理和药动力学有关内容联系在一起进行描述。

8.1免疫原性或生物效价的评价

应建立适当的实验及检测方法来评价该类制品的免疫原性或生物效价，如果有动物模型或可建立动物模型，可以采用动物模型直接评价该类制剂的生物效价，如：对一些有动物模型的感染性疾病，可以采用病毒的攻击实验来评价该类制剂的保护效果。而且要建立剂量与生物效价的关系，通过实验优化免疫程序和接种途径。 8.2耐受性以及基因组整合的分析

由于抗原在机体内长期表达可能诱发机体的免疫耐受或产生自身免疫反应，这个问题令科研工作者非常关注，但至今在成年动物中，并没有观察到因接种DNA疫苗而诱发的特异免疫耐受状态。Klinman[131]等用同一DNA疫苗免疫成年小鼠和新生小鼠，结果只在新生小鼠产生了免疫耐受，进一步研究证实，诱导新生小鼠免疫耐受的敏感性随年龄的增大而迅速消失。与Klinman等研究的结果相反，Marta[132用编码疟疾B细胞抗原表位基因的质粒免疫怀孕16天时的母鼠所产新生小鼠是可以产生特异性免疫的，Sechi[133]用含有分枝杆菌M.A.P基因的质粒pEGFP-N1免疫新生羊，也产生了特异性的Th1型细胞免疫应答。众多试验研究表明，免疫耐受的产生与接种质粒DNA没有直接联系，而是与试验动物的种类、接种途径和接种量有关。

由于重组DNA接种到机体以后，由于DNA疫苗免疫调节特征，在试验中发现细菌DNA可刺激正常小鼠产生抗DNA抗体，但随后Martin [134]等在大量不同的研究结果中均表明由常规DNA疫苗诱生的自身抗体水平还不足以导致活动性自身免疫病。此外，Gregor[135]等对无症状的HIV感染者注射DNA疫苗后，也没有检测到抗核酸抗体和临床并发症，因此，大量的动物和人体试验结果表明注射质粒DNA不会诱发自身免疫病。 如果质粒DNA整合到人体基因，可能造成人体基因的断裂或重排而诱发染色体的不稳定性，从而可能产生遗传毒性或致瘤反应。因此，在临床前的研究中应对基因在分布的组织及器官中，尤其是生殖腺系统和免疫系统是否发生整合进行检测的可能性进行分析；对重组DNA在接种部位组织及其它组织、器官的分布和持续时间进行追踪检测分析。如果实验证明重组DNA分布于大部分组织或器官，而且有足够的证据证明是否发生整合作用，或者该类制品将长期用于控制或预防非致命性疾病时，应对该类制品的致瘤性进行研究，尤其在重组DNA中有与人基因同源性很高的序列或有已知的潜在的致瘤性基因序列时，更应采用细胞或裸鼠进行致瘤性分析。就目前的研究而言，Kanellos 等 [136]用重组质粒免疫鱼和猩猩后，用Southern blotting检测，结果没有发现质粒DNA的整合。Martin[137]等用PCR检测质粒DNA肌注后在染色体中的整合情况，结果在1μg基因组中可检测到3-30个拷贝，这相当于自发突变率的三千分之一。

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